雜志:參數(shù)優(yōu)化和結(jié)果分析 ——METHODS 25, 402–408 (2001)
翻譯自:

       Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method 
       Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen
       Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and †Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
       Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534

摘要:

現(xiàn)在最常用的兩種分析實(shí)時定量 PCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法是絕對定量和相對定量。絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的 表達(dá)差異。 2 - △△ CT 方法是實(shí)時定量 PCR 實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。本文介紹了該方法的推導(dǎo)，假設(shè)及其應(yīng)用。另外，在本文中我們還介紹了兩種 2 - △△ CT 衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們在實(shí)時定量 PCR 數(shù)據(jù)分析中可能會被用到。

簡述:

反轉(zhuǎn)錄 PCR （ RT-PCR ）是基因表達(dá)定量非常有用的一種方法（ 1 － 3 ）。實(shí)時 PCR 技術(shù)和 RT-PCR 的結(jié)合產(chǎn)生了反轉(zhuǎn)錄定量 PCR 技術(shù)（ 4 ， 5 ）。實(shí)時定量 PCR 的數(shù)據(jù)分析方法有兩種：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過定量標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定我們所感興趣的轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)；相對定量方法則是用來確定經(jīng)過不同處理的 樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達(dá)差異。
   絕對定量通常在需要確定轉(zhuǎn)錄本絕對拷貝數(shù)的條件下使用。通過實(shí)時 PCR 進(jìn)行絕對定量已有多篇報(bào)道（ 6 － 9 ），包括已發(fā)表的兩篇研究論文（ 10 ， 11 ）。在有些情況下，并不需要對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對定量，只需要給出相對基因表達(dá)差異即可。顯然，我們說 X 基因在經(jīng)過某種處理後表達(dá)量增加 2.5 倍比說該基因的表達(dá)從 1000 拷貝 / 細(xì)胞增加到 2500 拷貝 / 細(xì)胞更加直觀。
    用實(shí)時 PCR 對基因表達(dá)進(jìn)行相對定量分析需要特殊的公式、假設(shè)以及對這些假設(shè)的驗(yàn)證。 2 - △△ CT 方法可用于定量 PCR 實(shí)驗(yàn)來計(jì)算基因表達(dá)的相對變化： 2 - △△ CT 公式的推導(dǎo) , 以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，有效性評估在 Applied Biosystems User Bulletin No.2(P/N4303859) 中有介紹。用 2 - △△ CT 方法分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)在文獻(xiàn)中也有報(bào)道 (5, 6) 。本文介紹了該方法的推導(dǎo)、假設(shè)以及應(yīng)用。另外，本文還介紹了 2 - △△ CT 兩種衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們在實(shí)時定量 PCR 數(shù)據(jù)分析中都可能被用到。

2-△△ CT 方法

PCR 指數(shù)擴(kuò)增的公式是：

·Xn 是第 n 個循環(huán)後目標(biāo)分子數(shù)。
·X0 是初始目標(biāo)分子數(shù)。
·Ex 是目標(biāo)分子擴(kuò)增效率。
·n 是循環(huán)數(shù)
·C T 代表目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)
因此：

·X T 是目標(biāo)分子達(dá)到設(shè)定的閾值時的分子數(shù)。
·C T,X 是目標(biāo)分子擴(kuò)增達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù)。
·Kx 是一個常數(shù)

對于內(nèi)參反應(yīng)而言，也有同樣的公式：

用 X T 除以 R T 得到：

對于使用 Taqman 探針的實(shí)時擴(kuò)增而言， X T 和 R T 的值由一系列因素決定：包括探針?biāo)鶐У臒晒鈭?bào)導(dǎo)基團(tuán)、探針序列對探針熒光特性的影響、探針的水解效率和純度以及熒光閾值的設(shè)定。因此常數(shù) K 并不一定等于 1 。
假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同：

或：

X N 代表經(jīng)過均一化處理過的初始目標(biāo)分子量； △ C T 表示目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因 C T 值的差異（ C T,X -C T,R ） 整理上式得：

最後用任一樣本 q 的 X N 除以參照因子（ calibrator ， cb ）的 X N 得到：

在這里

對于一個少于 150bp 的擴(kuò)增片斷而言，如果 Mg 2+ 濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴(kuò)增效率接近于 1 。因此目標(biāo)序列的量通過內(nèi)均一化處理之後相對于參照因子而言就是

2-△△ CT 方法的假設(shè)和應(yīng)用

    要使△△ C T 計(jì)算方法有效，目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率必須相等�？磧蓚�反應(yīng)是否具有相同的擴(kuò)增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋後擴(kuò)增產(chǎn)物△ C T 如何變化。
    圖 1 顯示的是 cDNA 樣品在 100 倍稀釋范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對于每一個稀釋樣本，都用 GAPDH 和 c-myc 特異的熒光探針及引物進(jìn)行擴(kuò)增。計(jì)算出 c-myc 和 GAPDH 的平均 C T 值以及△ C T 值，通過 cDNA 濃度梯度的 log 值對△ C T 值作圖，如果所得直線斜率絕對值接近于 0 ，說明目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增效率相同，就可以通過△△ C T 方法進(jìn)行相對定量。在圖 1 中，直線斜率是 0.047 ，因而假設(shè)成立，△△ C T 方法可以用來分析數(shù)據(jù)。如果兩個擴(kuò)增反應(yīng)效率不同，則需要通過定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和絕對定量的方法來進(jìn)行相對定量；或者也可以重新設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)條件使得目 標(biāo)序列和內(nèi)參序列具有相同的擴(kuò)增效率。

2-△△ CT 內(nèi)標(biāo)和參照因子的選擇

    使用內(nèi)標(biāo)基因的目的是為了對加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的 RNA 進(jìn)行均一化處理。標(biāo)準(zhǔn)的看家基因一般都可被用作內(nèi)標(biāo)基因。適合于實(shí)時 PCR 反應(yīng)內(nèi)標(biāo)基因包括 GAPDH ，β -actin, β 2 -microglobulin 以及 rRNA 。當(dāng)然，其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標(biāo)。我們推薦在應(yīng)用某一基因作為內(nèi)標(biāo)之前首先確證該基因的表達(dá)不會受實(shí)驗(yàn)處理的影響。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)處理是否對內(nèi)標(biāo)基因 表達(dá)產(chǎn)生影響的方法在 2.2 部分有描述。
    2-△△ CT 方法中參照因子的選擇決定于基因表達(dá)定量實(shí)驗(yàn)的類型。最簡單的設(shè)計(jì)就是把未經(jīng)處理的樣品作為參照因子（calibrator ）。經(jīng)內(nèi)標(biāo)基因均一化處理后，通過2-△△ CT 方法計(jì)算，目標(biāo)基因表達(dá)差異通過經(jīng)過處理的樣本相對于未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來表示。對于未經(jīng)處理的參照樣，△△ C T ＝ 0 ，而 2 0 ＝ 1 。 所以根據(jù)定義，未處理樣本的倍數(shù)變化為 1 。而對于那些經(jīng)過處理的樣本， 相對于參考因子基因表達(dá)的倍數(shù)為2-△△ CT 。同樣的分析也可用于不同時相的基因表達(dá)差異，在這種情況下，一般選 0 時刻的樣本作為參照因子。
    有些情況下，并不是比較不同處理樣本基因表達(dá)差異。例如，有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表達(dá)。在這種情況下，參照因子可能是另一器官中該 mRNA 的表達(dá)。表 1 顯示了大腦和腎臟總 RNA 中 c-myc 和 GAPDH 轉(zhuǎn)錄本的 CT 值。在這一個例子中，大腦被人為的選擇為參照因子，通過計(jì)算得到腎臟 c-myc 表達(dá)量經(jīng) GAPDH 校正後相對于大腦的表達(dá)量的結(jié)果。盡管相對定量方法可用于這種組織之間的比較，但結(jié)果的生物學(xué)解釋是相當(dāng)復(fù)雜的。不同種類細(xì)胞中目標(biāo)和參照轉(zhuǎn)錄本單一的相 對量變化可能在任何特定的組織中都存在。

    實(shí)時定量 PCR 所得到 C T 值可以很容易的輸出到表格程序如 Microsoft Excel 中去。為了顯示數(shù)據(jù)分析過程，我們在這里給出了一個基因表達(dá)定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和樣本列表。通過 β -actin 均一化處理，我們對目標(biāo)基因 fos-glo-myc 的表達(dá)變化進(jìn)行了監(jiān)測。在 8h 的時間范圍內(nèi)，在每一時間點(diǎn)都取 3 個重復(fù)樣本，每一樣本在 cDNA 合成之後都做定量 PCR ，數(shù)據(jù)分析用到了公式 9 ，即：

Time x 表示任意時間點(diǎn)， Time 0 表示經(jīng) β -actin 校正後 1 倍量的目標(biāo)基因表達(dá)。 
    0 時刻目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的平均 C T （見圖 2 第 8 欄）被用于公式 9 中。通過公式 9 計(jì)算出每一個樣本目標(biāo)基因表達(dá)通過 β -actin 均一化處理後相對于 0 時刻的倍數(shù)（見圖 2 第 9 欄）。平均 SD ， CV 由每一個時間點(diǎn)所取的三個重復(fù)樣求得。用這種分析方法，在 0 時刻的平均倍數(shù)變化接近于 1 。我們發(fā)現(xiàn)通過檢測在 0 時刻平均倍數(shù)變化是否為 1 可以很方便的驗(yàn)證三個重復(fù)樣品之間是否有錯誤或者誤差。如果得到的結(jié)果與 1 偏差很大 , 則表明存在計(jì)算錯誤或者是很高的實(shí)驗(yàn)誤差。
    在前面的例子中，在每一時間點(diǎn)上分別取了三個獨(dú)立的 RNA 樣本進(jìn)行了分析。因此對每一個樣本分別處理，通過2-△△ CT 計(jì)算後取結(jié)果的平均值就非常重要。如果是同一樣本進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增的重復(fù)，這就需要首先求出平均 C T, 然後再進(jìn)行2-△△ CT  計(jì)算。怎么樣計(jì)算平均值就要看目標(biāo)基因和內(nèi)參基因是在同一個管子中擴(kuò)增還是在不同的管子中擴(kuò)增。表 1 給出了目標(biāo)基因（ c- myc ）和內(nèi)參基因（ GAPDH ）在不同管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在這里不應(yīng)該把任一單個的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比較，而應(yīng)該分別計(jì)算出 c-myc 和 GAPDH 的平均 C T 來計(jì)算△ C T 。 重復(fù)實(shí)驗(yàn)中 C T 值的估計(jì)偏差通過標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)化成最後結(jié)果中相對量的變化。但其中的一個難點(diǎn)是 C T 值與相應(yīng)的拷貝數(shù)成指數(shù)關(guān)系（見第 4 部分） , 因此，在最後的計(jì)算中，2-△△ CT 的誤差通過△△ C T 加上標(biāo)準(zhǔn)偏差和△△ C T 減去標(biāo)準(zhǔn)偏差來評估，這就使得求得的數(shù)值相對于平均值呈不對稱分布。不對稱分布是因?yàn)榻Y(jié)果經(jīng)指數(shù)處理後轉(zhuǎn)化成量的線性比較造成的。
    通過不同熒光染料標(biāo)記的探針，我們可以在同一管中同時擴(kuò)增目標(biāo)序列和內(nèi)標(biāo)序列。表 2 給出了目標(biāo)基因（ c- myc ）和內(nèi)標(biāo)基因（ GAPDH ）在同一管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對于任意一個管子，目標(biāo)基因（ c- myc ）和內(nèi)參基因（ GAPDH ）擴(kuò)增時加入的 cDNA 量都是一樣多的，所以可以分別對每個管子計(jì)算△ C T 值，這些值取平均後再進(jìn)行 2-△△ CT 計(jì)算。 在這里估計(jì)誤差值也是一個不對稱的范圍，反映了誤差經(jīng)指數(shù)處理轉(zhuǎn)化為線性差異。 
    在表 1 和表 2 中，估計(jì)誤差在從△ C T 到△△ C T 的計(jì)算中未見有增加，這是因?yàn)槲覀儼褏⒄栈�因和檢測基因的誤差都顯示出來了。我們把△ C T,cb 當(dāng)作一個人為設(shè)定的常數(shù)來減去，得到△△ C T 。這樣得到的結(jié)果就與圖 2 所顯示的在求平均之前對不同重復(fù)樣本分別通過各自的 C T 值求2-△△ CT 所得結(jié)果 相當(dāng)。另一種方法是將參照基因當(dāng)作沒有任何誤差的１倍的量，在這種情況下，平均△ C T,cb 的誤差值被引入到每一樣本的△△ C T 中。在表１中，腎臟中△△ C T 變成－ 2.50±0.20 而經(jīng)過校正的 c-myc 量是 5.6 倍，范圍從 4.9 到 5.6 。而在大腦中的結(jié)果是沒有誤差的１倍.

2 -ΔCT ’ 方法

2 - △ CT ’ 方法的推導(dǎo)

通過內(nèi)標(biāo) RNA 可以對加入 RNA 的量的差異進(jìn)行校正。2-△△ CT方法的數(shù)據(jù)分析的一個特點(diǎn)就是能夠利用實(shí)時 PCR 實(shí)驗(yàn)的一部分?jǐn)?shù)據(jù)來完成這種校正。在其它的方法不能定量初始 RNA 量的時候：例如，在能得到的 RNA 量非常有限的時候或者需要處理高通量的樣品的時候，這一方法的優(yōu)勢就格外明顯。當(dāng)然我們也可以利用 PCR 實(shí)驗(yàn)以外的方法來完成這種校正。最常用的一種方法就是用紫外吸收來確定用于 cDNA 合成的 RNA 量，然後將相同的 RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 cDNA 用于 PCR 定量反應(yīng)。這種外標(biāo)法校正的一個應(yīng)用例子就是研究某種實(shí)驗(yàn)處理是否影響內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)。在這里，目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)合二為一。在這個例子中，公式 [2] 不被公式 [3] 除，公式［ 5 ］變成:

<整理得：

任一樣品Ｘ 0,q 除以參照品 X 0,cb 得：

在這里△ CT’=C T ,q-C T ,cb �！� C T’ 與前面計(jì)算中用的△ C T （用目標(biāo)基因 C T 值減去參照基因 C T 值）相互區(qū)別。

就象在 1.1 部分所描述的，如果條件優(yōu)化較好，效率接近于 1 ，內(nèi)標(biāo)相對于參照因子為：

2-△CT ’方法的應(yīng)用

2 - △ CT ， 方法的一個應(yīng)用就是確定實(shí)驗(yàn)處理對某一候選內(nèi)標(biāo)基因的影響。為了顯示這一過程，我們做了血清饑餓 / 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) (7) 。血清饑餓 / 誘導(dǎo)是研究某些 mRNA 降解的常用方法 (8) 。然而，血清可能影響一些基因的表達(dá)包括標(biāo)準(zhǔn)的看家基因的表達(dá)。

在 24-h 血清饑餓培養(yǎng)之後，在 NIH 3T3 細(xì)胞中加入 15% 血清誘導(dǎo)基因表達(dá)。從細(xì)胞中提取 Poly(A) + RNA ，并將之反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 。利用 SYBR Green 通過實(shí)時定量 PCR 檢測 GAPDH ，β 2 -microglobulin cDNA 的量。 GAPDH 和β 2 -microglobulin 各自的相對量通過 2 - △ CT ‘ 公式

求得。細(xì)胞處理對于 GAPDH 的基因表達(dá)有明顯影響，但對

β 2 -microglobulin 沒有什么影響。因此β 2 -microglobulin 很適合做血清刺激定量實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)，而 GAPDH 并不適合。這一例子向大家展示了在只研究一個基因的時候怎么用 2 - △ CT ‘ 的方法分析基因相對表達(dá)數(shù)據(jù)。

實(shí)時 PCR 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)時 PCR 最終分析的是閾值循環(huán)或 C 。

C T 值通過 PCR 信號的對數(shù)值和循環(huán)數(shù)來確定。 因此 C T 值是一個指數(shù)而非線性概念 。因此，在任何統(tǒng)計(jì)分析中都不要用原始的 C T 值來表示結(jié)果。正如我們在前文中所描述的一樣， PCR 相對量通常和內(nèi)標(biāo)和參照樣本一起計(jì)算而很少直接用 C T 值來表示，除非我們想檢驗(yàn)重復(fù)樣本之間的差別。為了向大家顯示這一點(diǎn)，我們用 SYBR Green 通過 real-time PCR 來檢測相同 cDNA 的 96 個重復(fù)反應(yīng)。所有反應(yīng)組分在同一管中混好後分裝到 96 個管中，做實(shí)時 PCR 分析，得到了每一個樣本的 C T 值。為了比較樣品間變化，計(jì)算了 96 個樣本的平均 ±SD ，如果通過原始 C T 值計(jì)算，平均 ±SD 是 20.00±0.193 ， CV 為 0.971% 。但是如果把原始 Ct 值用 2 -CT 轉(zhuǎn)化成線性形式，平均 ±SD 是 9.08 × 10 -7 ±1.33 × 10 -7 ， CV 為 13.5 ％。從這個簡單的例子我們可以看出，通過原始 CT 值來反映變化是錯誤的，應(yīng)該避免。用 2 -CT 將單個數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式來說明重復(fù)樣本之間的變化和差異更準(zhǔn)確可靠。

結(jié)論：

實(shí)時定量 PCR 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析可以采用相對定量和絕對定量兩種方法，研究人員在設(shè)計(jì)實(shí)時定量 PCR 實(shí)驗(yàn)分析基因表達(dá)的時候首先要問的一個問題就是：數(shù)據(jù)最後會以一個什么樣的形式得到。如果需要知道絕對的拷貝數(shù)，就必須用絕對定量的方法，否則只需要給出 基因表達(dá)相對量就足夠了。相對定量可能比絕對定量要更容易一些，因?yàn)樗�不需要作�?biāo)準(zhǔn)曲線。
    本文所給出的公式對于每個用相對定量的方法分析基因表達(dá)差異的研究人員都足夠了。下面，我們總結(jié)一下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和評估中的一些重要步驟：
    1. 選擇一個內(nèi)標(biāo)基因。
    2. 確定內(nèi)標(biāo)的有效性，確保它不會受到實(shí)驗(yàn)處理的影響。
    3. 通過 PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因 RNA 或 cDNA 的一系列梯度稀釋模板確保它們的擴(kuò)增效率相同。
    4. 最後通過 2 - △ CT 計(jì)算將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式而不是原始 C T 值。

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