ELISA試劑盒的選擇

瀏覽次數(shù)：6370　發(fā)布日期：2014-9-10　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

醫(yī)藥研發(fā)人員，尤其是各大醫(yī)藥研發(fā)公司的動(dòng)物模型，臨床實(shí)驗(yàn)的研究人員在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，需要選擇一些有疾病代表性的Biomarker，比如在特定適應(yīng)癥的臨床實(shí)驗(yàn)中的使用率，學(xué)術(shù)文章中的發(fā)表情況。如能有效掌握一些大數(shù)據(jù)，將給實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性提供了保證。

第一步：測(cè)什么Biomarker？

可以根據(jù)研究文獻(xiàn)的數(shù)量和臨床試驗(yàn)，比如TNF-a，在以下各大疾病的臨床實(shí)驗(yàn)中，和對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)中均有使用。當(dāng)然在炎癥，心血管疾病，糖尿病等疾病中的臨床試驗(yàn)和使用最多。

TNF-a在疾病中的應(yīng)用(數(shù)據(jù)僅供參考)	臨床實(shí)驗(yàn)	文獻(xiàn)數(shù)量
急性冠脈綜合征	2	27
急性腎損傷	1	10
與年齡相關(guān)的記憶障礙	1	1
alpha - 1抗胰蛋白酶缺乏癥	1	-
老年癡呆癥病	1	5
類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎	1	135
雙相情感障礙	1	-
癌癥,肛	1	-
癌、乳腺癌	3	30
癌、前列腺癌	1	15
心血管疾病	4	418
慢性腎臟疾病	3	37
慢性阻塞性肺疾病	3	23
常見(jiàn)的變量免疫缺陷	1	1
充血性心力衰竭	3	77
冠狀動(dòng)脈疾病	7	112
囊性纖維化	2	6
抑郁	1	24
糖尿病	9	100
杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥	1	-
移植物與宿主疾病	1	11
hemophagocyticlymphohistiocytosis	1	-
肝細(xì)胞癌	1	6
艾滋病毒感染	5	50
高血壓	1	39
炎癥	17	711
間質(zhì)性膀胱炎	1	-
肝硬化	1	14
肝衰竭	1	8
多發(fā)性硬化癥	1	32
肥胖	8	104
骨關(guān)節(jié)炎	1	11
骨質(zhì)疏松癥	1	24
胰腺炎	1	6
牙周炎	1	13
牛皮癬	2	48
呼吸窘迫綜合征	2	9
硬皮病	1	3
鐮狀細(xì)胞病	2	4
鼻竇炎	1	1
中風(fēng)	1	46
蛛網(wǎng)膜下腔出血	1	-
緊張型頭痛	1	-
創(chuàng)傷	1	-
潰瘍性結(jié)腸炎	3	13
血管炎	1	21

第二步：選什么試劑盒？

以TNF-a為例，Meso Scale Discovery® Vplex電化學(xué)發(fā)光試劑盒以0.04pg/mL的靈敏度是普通ELISA（7 pg/mL左右）的100多倍。如果實(shí)驗(yàn)樣本中的TNF-a低于7pg/mL,這就意味著實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)會(huì)無(wú)法檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)沒(méi)有定量結(jié)論。另外一個(gè)案例，臨床常規(guī)測(cè)定普通CRP的方法檢測(cè)線性一般為3~200mg/L，而預(yù)測(cè)心血管事需要更高靈敏度的CRP，超敏或高敏CRP （hs-CRP）。

類(lèi)型	指標(biāo)（Human）	靈敏度（pg/mL）		提升靈敏度（倍）
類(lèi)型	指標(biāo)（Human）	超敏Vplex	普通ELISA	提升靈敏度（倍）
炎癥因子	IFN-g	0.2	8	40
	IL-1b	0.04	1	25
	IL-2	0.09	7	78
	IL-4	0.02	10	500
	IL-6	0.06	0.6	10
	IL-8	0.04	7.5	188
	IL-10	0.03	3.9	130
	IL-12p70	0.11	5	45
	IL-13	0.24	57.4	239
	TNF-a	0.04	7.1	178
細(xì)胞因子	GM-CSF	0.14	3	21
	IL-1a	0.09	1	11
	IL-5	0.22	2	9
	IL-7	0.16	5	31
	IL-12/IL23p40	0.39	15	38
	IL-15	0.17	2	12
	IL-16	2.83	13.4	5
	IL-17A	0.74	15	20
	TNF-b	0.05	5.5	110
	VEGF	1.12	9	8
趨化因子	Eotaxin	3.26	5	2
	MIP-1b	0.37	10	27
	Eotaxin-3	1.77	5.2	3
	TARC	0.22	7	32
	IP-10	0.37	4.46	12
	MIP-1a	3.02	10	3
	MCP-1	0.09	10	111
	MDC	1.22	62.5	51
	MCP-4	1.69	7.81	5
老年癡呆	Total Tau	1.07	12	11
	Abeta40	5.41	100	18
	Abeta42	0.516	100	194
血管生成	VEGF-C	11.1	48.4	4
	VEGF-D	2.53	31.3	12
	Tie-2	21.1	66	3
	Flt-1	0.56	13.3	24
	PIGF	0.32	7	22
	bFGF	0.08	3	38
血管創(chuàng)傷	SAA	10.9	368	34
	CRP	1.33	22	17
	VCAM-1	6	1260	210
	ICAM-1	1.03	254	247

第三步：檢測(cè)什么樣本？試驗(yàn)周期多長(zhǎng)？

如需要檢測(cè)的是尿液，檸檬酸鹽血漿樣本，需在訂購(gòu)前仔細(xì)查看ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)中的驗(yàn)證樣本。簡(jiǎn)單的說(shuō)，如果ELISA試劑盒是沒(méi)有用過(guò)試劑盒檢測(cè)尿樣，檸檬酸鹽血漿，使用該試劑盒檢測(cè)尿樣會(huì)存在極大的風(fēng)險(xiǎn)；而且很多ELISA試劑盒中還會(huì)特別說(shuō)明“不能檢測(cè)檸檬酸鹽血漿”。Vplex試劑盒驗(yàn)證過(guò)的樣本有血清， EDTA血漿，肝素血漿，檸檬酸鹽血漿，尿液，細(xì)胞上清液。

如自己采購(gòu)抗體，開(kāi)發(fā)ELISA方法學(xué)，如遇到抗體親和力低，由于ELISA的兩次洗脫將可能將抗體洗掉，大大影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Meso Scale Discovery® 可以不用洗，2.5小時(shí)完成實(shí)驗(yàn)的一步法。

如實(shí)驗(yàn)研究周期較長(zhǎng)，ELISA試劑盒盡量選擇一個(gè)批次的，以防止不同批次間的差異。然而由于普通ELISA有效期在3-12個(gè)月，而實(shí)驗(yàn)周期往往在1-2年以上，一些長(zhǎng)期臨床實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目甚至在5-10年，因而經(jīng)常面臨不同批次的挑戰(zhàn)。而Meso Scale Discovery®Vplex試劑盒經(jīng)過(guò)54個(gè)月穩(wěn)定性測(cè)試。使用Vplex，完全可以用一個(gè)批次支持2-3年的實(shí)驗(yàn)。更多細(xì)節(jié)可以比較下表格：

	Meso Scale Discovery® 超敏Vplex試劑盒	普通ELISA試劑盒
試劑盒驗(yàn)證過(guò)的樣本	血清， EDTA血漿，肝素血漿，檸檬酸鹽血漿，尿液，細(xì)胞上清液	血清， EDTA血漿，肝素血漿，細(xì)胞上清液
實(shí)驗(yàn)流程	可以免洗，無(wú)需洗板，2.5小時(shí)	需要洗2次，6小時(shí)以上
驗(yàn)證	靈敏度，準(zhǔn)確度精確度，基質(zhì)效應(yīng)和不同類(lèi)型樣本，特異性，54個(gè)月穩(wěn)定性測(cè)試	靈敏度，準(zhǔn)確度精確度，基質(zhì)效應(yīng)和不同類(lèi)型樣本，特異性
試劑盒檢測(cè)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)	54個(gè)月穩(wěn)定性測(cè)試，3次凍融測(cè)試。	無(wú)。有效期在3-12個(gè)月。
校正數(shù)據(jù)	使用NIBSC/WHO對(duì)照	只有高端試劑盒才使用NIBSC/WHO對(duì)照
正常人樣本數(shù)據(jù)檢測(cè)	血清，EDTA血漿，肝素血漿，檸檬酸鹽血漿，尿液	血清，EDTA血漿，肝素血漿
LPS刺激樣本檢測(cè)	全血樣本，PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞），THP-1（人類(lèi)單核巨噬細(xì)胞）	無(wú)

美國(guó)Meso Scale Discovery(MSD)：成立于1995年，在2009年全球首次檢測(cè)到人攜帶甲型H1N1病毒，在2013年被評(píng)為“全球前五的免疫分析品牌”。其研發(fā)的基于微孔板的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)（簡(jiǎn)稱(chēng)：微孔板ECL ）是全面升級(jí)/替代ELISA， Western Blot，多蛋白因子檢測(cè)的第三代免疫分析技術(shù)。已經(jīng)廣泛被醫(yī)藥研發(fā)中心、藥物安全性評(píng)價(jià)中心、GLP實(shí)驗(yàn)室、合同外包企業(yè)（CRO）、診斷、生物技術(shù)企業(yè)應(yīng)用于藥物篩選，動(dòng)物模型，藥物代謝，血藥濃度，免疫原性，中和實(shí)驗(yàn)，Biomarker篩選，抗體親和力，疫苗評(píng)估，宿主細(xì)胞殘留，診斷研究。

美國(guó)Meso Scale Discovery(MSD)部分應(yīng)用方向：

1、細(xì)胞因子研究：實(shí)現(xiàn)多因子研究，常規(guī)靈敏度達(dá)0.05pg/ml。符合GLP要求的多因子檢測(cè)。

2、信號(hào)通路研究：可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)Phospho/Total磷酸化蛋白的研究，僅需4.5小時(shí)。

3、神經(jīng)退行性疾病研究：使用了腦脊液CSF等復(fù)雜基質(zhì)樣本檢測(cè)，無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。

4、藥物安全性評(píng)估：符合FDA標(biāo)準(zhǔn)的高敏多指標(biāo)檢測(cè)。

5、免疫原性評(píng)估：可兼容高達(dá)50ug/ml高濃度血藥干擾，達(dá)到<100ng/ml的ADA檢測(cè)靈敏度，符合FDA要求。

6、抗體亞型分型：快速鑒定樣本中不同亞型，可達(dá)0.1ng/ml的靈敏度水平

7、抗體表位分析：一次鑒定多達(dá)10種不同表位。

8、多價(jià)疫苗效價(jià)評(píng)估：縮短至1.5小時(shí)的評(píng)估流程。

9、抗體親和力測(cè)試：基于SET方法學(xué)的親和力測(cè)定，可分析高達(dá)10-15的親和力樣本。

10、中和抗體測(cè)定：基于細(xì)胞水平，更符合實(shí)際生物體要求。

11、細(xì)胞水平結(jié)合測(cè)試：Cell Base Binding測(cè)試，多達(dá)6log線性范圍，能夠鑒定細(xì)胞表面受體與對(duì)應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合水平及親和力