鹽酸莫西沙星注射液中雜質(zhì)的檢測及結(jié)構(gòu)鑒定
王志英
沃特世科技(上海)有限公司
前言:
莫西沙星(Moxifloxacin)為人工合成的喹諾酮類抗菌藥,是一類較新的合成抗菌藥。具有抗菌性強(qiáng)、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性,并對常見耐藥菌有效、半 衰 期 長、不良 反 應(yīng) 少 等 優(yōu) 點(diǎn)。臨 床 上 用 于 治 療 呼 吸 系 統(tǒng) 感 染 、生 殖系統(tǒng)感染、皮膚軟組織感染等。莫西沙星原研廠家為德國拜耳,其注射劑在中國的專利保護(hù)期即將到期,國內(nèi)也有多個(gè)廠家正在進(jìn)行莫西沙星的仿制。但如今基于藥品安全的考慮,仿制藥中的有關(guān)物質(zhì)的檢測越發(fā)引起注意,中國藥典上也明確規(guī)定,藥物中雜質(zhì),含量高于0.1%的所有雜質(zhì)均需對其雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒別(毒性藥物限度則更低)。所 以 ,如 何 高 效 快 速 地 測定藥物中的雜質(zhì),這一課題逐漸成為藥物研究過程中亟待解決的難點(diǎn)。
本文采用沃特世(Waters®)超高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜(ACQUITY UPLC/Xevo G2-S QTof)聯(lián)用技術(shù)對莫西沙星注射液(光照10天)樣品中雜質(zhì)進(jìn)行分析,采用亞2 µm色譜柱UPLC方 法 ,使 整 個(gè) 分 離 時(shí) 間 由60分鐘縮短至25分鐘 ,且 雜 質(zhì) 得 到 有 效 分 離 ;應(yīng) 用MassLynx和MetaboLynx軟 件 ,自 動 得 到 包 含各個(gè)雜質(zhì)分子量、分子式、及結(jié)構(gòu)信息的雜質(zhì)列表,使整個(gè)雜質(zhì)鑒定過程高效快速、節(jié)省人力。
實(shí)驗(yàn)條件:
實(shí)驗(yàn)流程:
結(jié)果和討論:
使用方法轉(zhuǎn)換器及色譜柱選擇卡,將客戶提供的HPLC普通液相平行轉(zhuǎn)化為UPLC方法,如表1。圖3為客戶使用HPLC得到的紫外譜圖,圖4為轉(zhuǎn)化為亞2 μm色譜柱后得到的紫外譜圖。從結(jié)果可看出,分析時(shí)間由60分鐘縮短至25分鐘,流速由1.0 mL/min降低到0.45 mL/min,使用UPLC可提高效率、大大節(jié)省成本;同時(shí),從譜圖的分離度及響應(yīng)來看,UPLC的分離度更好,響應(yīng)更高(進(jìn)樣量由5 μL降為1 μL)。其中譜圖中紅色箭頭處幾個(gè)大峰為我們特別關(guān)注的雜質(zhì)。
圖3. 客戶使用HPLC得到的紫外譜圖
圖4. 轉(zhuǎn)化為亞2 μm色譜柱后得到的紫外譜圖
與液相紫外相連的為Xevo G2-S QTof質(zhì)譜,采用MSE這種簡單實(shí)用的專利技術(shù)采集樣品,可以實(shí)現(xiàn)樣品進(jìn)樣一次同時(shí)得到一級質(zhì)譜圖和豐富的離子碎片信息,其中包括了母離子掃描、子離子掃描和中性丟失掃描的結(jié)果,并且避免了雜質(zhì)信號的丟失。如圖5為一針進(jìn)樣同時(shí)得到莫西沙星注射液(光照10天)樣品的一級質(zhì)譜總離子流圖、二級質(zhì)譜總離子流圖。圖6為主峰的一級和二級質(zhì)譜圖。
圖5. 一針進(jìn)樣即可得到莫西沙星注射液(光照10
天)樣品的一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜總離子流圖
采用MassLynx軟件,通過準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)和同位素匹配確定分子式,之后再根據(jù)二級碎片質(zhì)譜對結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。以主峰為例說明判斷分子式的過程,如圖7確認(rèn)分子式。再通過軟件MassFragment功能對二級碎片進(jìn)行自動解析,如圖8,可看出,其碎片的精確度也非常好,質(zhì)量偏差很小。
圖7. 通過準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)和同位素分布來確定分子式(以主峰為例)
圖8. 通過準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)和同位素分布來確定分子式
使用MetaboLynx對雜質(zhì)進(jìn)行自動解析,其解析結(jié)果界面如圖9,可以自動得到雜質(zhì)列表,其中包含分子量、分子式、質(zhì)量偏差、峰面積及其結(jié)構(gòu)信息。軟件還自動顯示每個(gè)雜質(zhì)在樣品中的提取離子流圖、在空白中的提取離子流圖、一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖,使雜質(zhì)的分析更明確。通過此軟件可快速得到其整個(gè)樣品譜圖上所有雜質(zhì)的信息,具體如圖10顯示。其中從“質(zhì)量偏差(mDa)”可看出由Xevo G2-S QTof可獲得很好的質(zhì)量精度,其質(zhì)量偏差在0.8 mDa以內(nèi)!半s質(zhì)與母藥關(guān)系”一欄,可快速獲得其結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息。如寫“Hydroxylation”即“主峰的結(jié)構(gòu)+O”,“Hydroxylation + desaturation ”即“主峰的結(jié)構(gòu)+O-H2”。另外出現(xiàn)如(R_0:-CH2)等“R_”的形式是指軟件自動對主峰進(jìn)行烷基化斷裂后的結(jié)構(gòu)(軟件已自動給出結(jié)構(gòu)),如“Hydration-CH2 (R_0:-CH2)”即指“主峰-CH2后的結(jié)構(gòu)再+H2O-CH2”,其結(jié)構(gòu)也已呼之欲出。
圖9. MetaboLynx對雜質(zhì)進(jìn)行自動解析的界面
圖10. 通過軟件自動得到的莫西沙星注射液(光照10天)樣品雜質(zhì)列表,包含雜質(zhì)峰m/z、保留時(shí)
間、分子量、分子式、質(zhì)量偏差、峰面積及具體的結(jié)構(gòu)信息等
客戶特別關(guān)心的三個(gè)大峰紫外譜圖中5.93 min、8.60 min、18.68 min的雜質(zhì)信息如表2。其中5.93 min和8.60 min的峰包含有多個(gè)雜質(zhì),未完全分開。從圖11中,RT 5.93 min的一級質(zhì)譜圖可看出:m/z 187.5981為帶了雙電荷的分子離子,與m/z 374.1880為同一化合物,且m/z 374.1880的含量較高。圖12可以看出,200.5981為帶了雙電荷的分子離子,與400.1866為同一化合物,此雜質(zhì)濃度較高。圖11、12、13分別列出了這三個(gè)色譜峰的一級質(zhì)譜圖、每個(gè)雜質(zhì)組分的二級質(zhì)譜圖及可能的結(jié)構(gòu)。
圖11. 紫外譜圖中RT 5.93 min峰包含的雜質(zhì)一級及二級質(zhì)譜圖及可能結(jié)構(gòu)
圖12. 紫外譜圖中RT 8.60 min峰包含的雜質(zhì)一級及二級質(zhì)譜圖及可能結(jié)構(gòu)
圖13. 紫外譜圖中RT 18.68 min峰包含的雜質(zhì)一級及二級質(zhì)譜圖及可能結(jié)構(gòu)
結(jié)論:
本實(shí)驗(yàn)將常規(guī)HPLC色譜柱檢測方法平行轉(zhuǎn)化為亞2 μm的UPLC色譜柱檢測,分析時(shí)間由60 min縮短至25 min,大大提高分析效率,同時(shí)流速由1 mL/min降至0.45 mL/min,節(jié)約了溶劑成本。分離度及出峰情況與原譜圖保持一致。應(yīng)用Xevo G2-S QTof能得到最準(zhǔn)確的分子量,其雜質(zhì)質(zhì)量偏差在0.8 mDa以內(nèi),同時(shí)利用MeteboLynx智能軟件,快速得到包含所有雜質(zhì)峰m/z、保留時(shí)間、分子量、分子式、質(zhì)量偏差、峰面積及具體結(jié)構(gòu)信息的雜質(zhì)列表,提取離子流圖、一級和二級質(zhì)譜圖等信息,大大節(jié)省人力及時(shí)間。通過此雜質(zhì)列表及質(zhì)譜圖可得到雜質(zhì)的可能結(jié)構(gòu),再通過MassFragment功能對雜質(zhì)二級碎片結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配進(jìn)而確定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。從此推斷流程可看出,在高效的UPLC、精準(zhǔn)的QTof儀器及強(qiáng)大的智能軟件幫助下,復(fù)雜的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定工作變得更簡單輕松,對人員的經(jīng)驗(yàn)、資歷背景依賴性降低,大大節(jié)省人力、物力和時(shí)間成本,對于藥物的有關(guān)物質(zhì)研究工作起到積極的推動作用。