HERG (human ether-a go-go-related gene) K+ 通道在心臟中高表達(dá)，是心肌動(dòng)作電位三期快速?gòu)?fù)極化電流(IKr)的主要組成部分(Curran ‘95; Sanguinetti ‘95)。hERG 突變引起的功能缺失常伴隨一些遺傳性長(zhǎng)QT 綜合癥(LQTS) 并且會(huì)增加發(fā)生嚴(yán)重的室性心律失常, 扭轉(zhuǎn)性實(shí)行心動(dòng)過(guò)速 (Tanaka ‘97; Moss ‘02)的風(fēng)險(xiǎn)。HERG 鉀離子通道被作用于心臟或非作用于心臟的藥物抑制，都被證實(shí)有非常大的可能性出現(xiàn)獲得性藥物誘導(dǎo)的長(zhǎng)QT 綜合癥(LQTS)，甚至導(dǎo)致猝死(Vandenberg, Walker & Campbell ‘01)。實(shí)際上，hERG 鉀離子通道被抑制引起的副作用是近年來(lái)藥物撤市的要原因，因而藥物作用于外源性表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的hERG 通道的體外效應(yīng)評(píng)價(jià)已被 國(guó)際藥品注冊(cè)協(xié)調(diào)會(huì)議（International Conference on Harmonization）推薦作為臨床前安全性評(píng)價(jià)工作的一部分(ICHS7B Expert Working Group, ‘02)。hERG 鉀離子通道藥物效應(yīng)評(píng)價(jià)的金標(biāo)準(zhǔn)方法是手動(dòng)膜片鉗記錄。然而，這種低通量、高成本的方法在大量的安全性篩選實(shí)驗(yàn)中非常受限制。近年來(lái)，全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)發(fā)展越來(lái)越成熟，可以獲得高通量的、可與手動(dòng)膜片鉗記錄結(jié)果相媲美的數(shù)據(jù)。IonFlux™ 系統(tǒng)結(jié)合了讀板機(jī)的便捷和傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)的優(yōu)秀性能。本文主要利用IonFlux 系統(tǒng)記錄了在哺乳細(xì)胞中表達(dá)的hERG 電流以及一些陽(yáng)性抑制劑對(duì)hERG 阻斷效應(yīng)的藥理學(xué)特性分析。

 

細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)中使用G418 篩選的穩(wěn)定表達(dá)hERG 通道的CHO 細(xì)胞（Millipore PrecisION™ hERG-CHO Recombinant Cell Line, Cat# CYL3038）。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的Glutamax DMEM/F12 培養(yǎng)基 (Gibco,Cat# 11320) ，加有1% 青霉素-鏈霉素以及500 μg/mL G418。實(shí)驗(yàn)前至少提前24 小時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至30℃培養(yǎng)箱中，或傳代后一直放置在30℃培養(yǎng)箱中。細(xì)胞密度不能超過(guò)90%。收集細(xì)胞時(shí)，使用Detachin(Genlantis, San Diego, CA, Cat# T100100)消化細(xì)胞，沖洗并輕柔吹打，最后細(xì)胞懸浮在細(xì)胞外液中，濃度為每毫升2-5 百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。

溶液和化合物

細(xì)胞外液成分（ECS）含有（mM）：NaCl 145, KCl 4, MgCl2 1, CaCl2 2,HEPES 10, 葡萄糖 10，用NaOH 調(diào)pH 至7.4 。細(xì)胞內(nèi)液成分（ICS）含有（mM）：KCl 120, HEPES 10, Na2ATP 4, EGTA 10, CaCl2 5.374,MgCl2 1.75，用KOH 調(diào)pH 至7.2。

hERG 抑制劑購(gòu)自Sigma�；�合物第一步全部溶于DMSO 中，制成高濃度的母液（10-50 mM），然后按照濃度梯度和最終外液中的終濃度的倍數(shù)關(guān)系進(jìn)行下一步的稀釋，因而最終相應(yīng)的DMSO 濃度為（0.1- 0.3%）。DMSO 溶液（0.1- 0.3%）作為陰性對(duì)照的記錄始終開(kāi)始于抑制劑作用之前，且規(guī)定不能對(duì)電流幅度的影響超過(guò)10%。

 

 

Figure 1. IonFlux 高通量全自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)，采用“讀板機(jī)”式模式，簡(jiǎn)化了工作流程、增加了實(shí)驗(yàn)通量。系統(tǒng)配有16 通道和64 通道兩種型號(hào)，每天可以記錄獲取10,000 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。

 

 

IonFlux記錄板的每個(gè)孔分別加入250 μL內(nèi)液、化合物、以及細(xì)胞懸液。IonFlux記錄板的規(guī)格和加液處理與標(biāo)準(zhǔn)的多孔板完全一致，主要區(qū)別之處在于記錄板的底部加裝了互相獨(dú)立的微流體孔道網(wǎng)絡(luò)用于連接、運(yùn)送試驗(yàn)孔中不同的液體。在溶液添加結(jié)束后，所有氣壓控制步驟全部通過(guò)機(jī)器自身來(lái)完成，包括細(xì)胞捕獲、形成封接、化合物添加，以及沖洗等。

 

IonFlux-16系統(tǒng)包含了16個(gè)獨(dú)立的放大器。編輯好的電壓刺激命令同步作用于所有的16個(gè)記錄通道。系統(tǒng)采用20個(gè)細(xì)胞集合記錄的模式，即一個(gè)放大器對(duì)應(yīng)的記錄位點(diǎn)中同時(shí)記錄20個(gè)細(xì)胞的電流結(jié)果并取其總和值作為最終的數(shù)據(jù)，從而大大提高數(shù)據(jù)的一致性以及實(shí)驗(yàn)成功率。在本次hERG實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞被鉗制在-80mV，且超極化至-100mV以監(jiān)控串聯(lián)電阻的變化。hERG在+50mV(800ms)被激活，然后外向尾電流在-50mV時(shí)被記錄，激活前-50mV的刺激將作為基線電流用于最終結(jié)果的分析。-50mV之后繼續(xù)超極化至-120mV(800ms)主要用于hERG通道從失活過(guò)程的恢復(fù)（見(jiàn)圖2）。在研究電壓-電流關(guān)系（IV反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)中，采用了從-50mV至60mV 12個(gè)10mV步階激活刺激命令，或者從-120mV至+50mV的18個(gè)10mV的去極化步階刺激命令（見(jiàn)圖3）。電壓刺激命令每隔6秒運(yùn)行一次。漏電流通過(guò)在線的兩組小脈沖來(lái)補(bǔ)償（-80mV至-100mV，50ms/50ms）。采樣頻率為5kHz，實(shí)驗(yàn)在室溫中進(jìn)行（20-23°C）。

 

在藥理學(xué)特性研究中，hERG電流穩(wěn)定后（~5min），同一個(gè)化合物按照濃度從低到高（包括0.1-0.3%DMSO溶液的陰性對(duì)照）依次添加至細(xì)胞記錄位點(diǎn)，持續(xù)3~5分鐘。加樣方式包括依次累加給藥刺激或每個(gè)濃度間隔外液沖洗兩種方式。

全細(xì)胞 hERG 離子通道電流示例

 

圖2顯示了電壓刺激方波（上圖）和典型的室溫下hERG離子通道實(shí)時(shí)電流軟件截屏圖（下圖）。圖中16個(gè)放大器對(duì)應(yīng)的16個(gè)通道的hERG電流結(jié)果在展現(xiàn)在一張圖中，以不同顏色表示。漏電流補(bǔ)償通過(guò)機(jī)器自動(dòng)完成。電阻和電流的幅度(I) 通過(guò)標(biāo)記的游標(biāo)（cursor）位置（粉色和亮綠色用于電阻的計(jì)算，綠色和藍(lán)色用于電流計(jì)算）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

 

Figure 3. 室溫下記錄的hERG 電流的電壓-電流關(guān)系。細(xì)胞鉗制在-80 mV。(A) 顯示了一個(gè)典型的不同激活步階電壓下記錄到的hERG 電流。激活電流的IV 點(diǎn)線圖和-50mV 尾電流的電壓激活曲線圖分別展現(xiàn)于(C)和(D)。全部hERG 細(xì)胞全激活的電流圖和IV 點(diǎn)線圖分別顯示在 (B) 和(E)。 

 

 

室溫下記錄的hERG 電流的電壓-電流關(guān)系顯示于圖3。細(xì)胞鉗制在-80 mV。圖3 的A 圖顯示了一個(gè)典型的不同激活步階電壓下記錄到的hERG 電流。 細(xì)胞從–60 mV 至 60 mV 逐漸去極化，持續(xù)時(shí)間800 ms，以激活hERG 電流， 然后再?gòu)?fù)極化至-50 mV 以記錄外向尾電流。激活電流的IV 點(diǎn)線圖和-50mV 尾電流的電壓激活曲線圖分別展現(xiàn)于(C)圖和(D)圖。Boltzmann 方程擬合的電壓激活曲線得到的半數(shù)最大電流的激活電壓是–6±0.3mV(D 圖)。此數(shù)據(jù)結(jié)果與之前發(fā)表的全自動(dòng)膜片鉗結(jié)果一致(PatchX- press, Guo & Guthrie, 2005)，且與23 °C 條件下記錄的手動(dòng)膜片鉗結(jié)果相比較大約偏移了8mV左右(-14mV, Zhou et al., 1998)。全部hERG 細(xì)胞全激活的電流圖和IV 點(diǎn)線圖分別顯示在 (B 圖) 和(E 圖)，電流在去極化至50mV 的步階刺激中被激活，然后復(fù)極化至不同電壓水平。尾電流-94 mV 時(shí)被翻轉(zhuǎn)；在更副的電壓水平下電流變?yōu)閮?nèi)向。

 

Figure 4. 長(zhǎng)時(shí)間hERG 記錄和兩種化合物添加方式。實(shí)驗(yàn)軟件截屏圖顯示了兩個(gè)化合物的依照濃度梯度累積給藥，以及隨后每個(gè)濃度間隔外液沖洗后再給藥的方式。

 

 

 

 

 

 

 

hERG 抑制劑的 IC50

獲得全細(xì)胞模式后，hERG 電流可以持續(xù)記錄超過(guò)60 分鐘（最多120 分鐘）（見(jiàn)圖4 示例）。因而，在同一種細(xì)胞上兩種不同加樣方式均可以用來(lái)檢測(cè)化合物的IC50 值。

每個(gè)試驗(yàn)區(qū)同一個(gè)細(xì)胞最多可以檢測(cè)包含最多8 個(gè)化合物。圖4 中顯示的示例點(diǎn)線圖展示了兩種不同的量效實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ健�C1、C2、和C3 代表從低到高的三個(gè)不同濃度（在不同試驗(yàn)區(qū)中可以是相同或不同的濃度） 。首先，C1、C2、C3 在依次累積加樣方式下分別重復(fù)2 次給藥， 然后再按照每個(gè)濃度間隔外液沖洗后再給藥的方式加樣(Fig. 4)。 順序給藥不同濃度后（ 依次累加或間隔沖洗） 均導(dǎo)致了h E R G 電流在每個(gè)濃度產(chǎn)生相似的抑制率在本次實(shí)驗(yàn)中，兩種不同的化合物（阿米替林和西沙比利，Amitriptyline 和Cisapride）被添加在記錄板的不同試驗(yàn)區(qū)。其IC50 值來(lái)自于各自獨(dú)立的細(xì)胞產(chǎn)生的量效曲線的擬合和計(jì)算。

多個(gè)已知得得hERG 抑制劑的IC50 值來(lái)自于圖5 所示例電費(fèi)Hill 方程的曲線擬合。其結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)在表1 中進(jìn)行了比較。

 

 

本實(shí)驗(yàn)成功驗(yàn)證了IonFlux平臺(tái)在hERG鉀電流研究和hERG通道抑制化合物篩選等方面的應(yīng)用。多細(xì)胞的集合記錄展現(xiàn)出了更高的成功率和電流更穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，特別在長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)記錄時(shí)。hERG電流的激活和失活表現(xiàn)出了與手動(dòng)膜片鉗記錄結(jié)果相似的電壓依賴性特點(diǎn)。由于hERG電流的長(zhǎng)時(shí)間記錄（>60分鐘）、化合物的快速加樣和沖洗、以及加樣過(guò)程中電壓依賴性電流連續(xù)監(jiān)控等特點(diǎn)，可以在一次實(shí)驗(yàn)中同樣的細(xì)胞條件設(shè)置下得到多個(gè)化合的IC50值。IonFlux平臺(tái)記錄獲得的IC50值與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是一致的(Redfern‘03;Guo&Guthrie‘05)。即使是疏水性的化合物也顯示出了良好的與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果的一致性：TerfenadineIC50=25nM、Bepredil IC50=54nM 以及Astemizole IC50=15nM。

 

hERG 通道的藥物效應(yīng)高通量篩選在藥物安全性實(shí)驗(yàn)中起到至關(guān)重要的作用�；�合物高效數(shù)據(jù)的獲取顯示了IonFlux 在hERG 篩選和化合物特性分析方面是一值得擁有的高效工具。

 

Table 1. IonFlux 系統(tǒng)記錄的多個(gè)已知hERG 抑制劑的IC50 值與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果（右側(cè)）的比較表。cLogP 值反應(yīng)了相應(yīng)化合物的疏水性。

 

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