Jennifer L. Simeone and Paul D. Rainville

目的
對蛋白沉淀血漿中的強極性化合物直接進樣分離，以進行生物分析。

背景
大多數(shù)生物分析方法都采用蛋白質(zhì)沉淀(PPT)提取法，這是因為該技術(shù)簡單、快速且成本較低。典型的PPT使用3:1的有機溶劑與生物樣品，可得到大約75%的有機提取物。傳統(tǒng)上，通常會采用反相液相色譜(RPLC)分析樣品。對于強極性化合物而言，由于強溶劑作用產(chǎn)生的色譜峰形較差，最為明顯的是出現(xiàn)峰前伸和/或譜峰分叉，因此不能直接將高濃度有機提取物注入RPLC系統(tǒng)。因此，在向色譜系統(tǒng)進樣之前需要進行額外的樣品處理，包括蒸發(fā)和復(fù)溶或用水稀釋。

通過從RPLC到UPC²改變MS入口技術(shù)，無需蒸發(fā)和復(fù)溶等額外樣品制備步驟，便可以直接進樣分離高度有機樣品中的極性化合物。

圖1. 在反相模式下運行的UPLC®中，咖啡因PPT提取物通過(a)1 µL進樣、(b)3µL進樣獲得的示例色譜圖，以及在ACQUITY UPC²系統(tǒng)中，相同咖啡因PPT提取物的(c)7µL進樣示例色譜圖。

解決方案
UltraPerformance Convergence Chromatography™(UPC²®)使用超臨界二氧化碳作為主要流動相，其保留機制與RPLC不同，可直接進樣高度有機提取物。在本示例中，通過PPT提取法使用乙腈以3:1的比率從大鼠血漿中提取了四種極性較強的化合物，直接進樣至ACQUITY UPC²™系統(tǒng)中，并使用傳統(tǒng)RPLC系統(tǒng)作為對比。UPC²分析在ACQUITY UPC² BEH色譜柱上進行，采用經(jīng)氫氧化銨改性的甲醇作為共溶劑(流動相B)。RPLC分析在配備ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱的ACQUITY UPLC®系統(tǒng)上進行，采用水和經(jīng)氫氧化銨改性的乙腈作為流動相。

圖1將含咖啡因的PPT提取物在ACQUITY UPLC系統(tǒng)中的1µL直接進樣和3 µL直接進樣與在ACQUITYUPC²系統(tǒng)中的7µL進樣進行了對比。RPLC中的1µL進樣顯示出良好的峰形，但在3µL進樣體積下峰形發(fā)生變形，可以觀察到前伸峰和譜峰分叉。而采用UPC²進行的7µL進樣依然表現(xiàn)出良好的峰形。以相同方式測試的其它極性分子也觀察到類似的結(jié)果(表1)。表1還顯示了使用RPLC和UPC²時，在PPT提取物中測試的所有分析物的最大進樣體積。

這些數(shù)據(jù)明確證實了使用ACQUITY UPC²系統(tǒng)分析高度有機提取物中極性化合物的優(yōu)勢，并且不必像RPLC系統(tǒng)那樣在進樣前需要進行額外的樣品制備，從而簡化了工作流程。

總結(jié)
通過從標(biāo)準(zhǔn)RPLC到UPC²改變MS入口技術(shù)，無需蒸發(fā)和復(fù)溶等額外樣品制備步驟，便可以直接在ACQUITY UPC²系統(tǒng)中注入溶于高度有機樣品中的極性化合物。為生物分析實驗室增添UPC²可以簡化高度有機樣品制劑中極性化合物的分析。