Jessalynn P. Wheaton，Erin E. Chambers和Kenneth J. Fountain

應(yīng)用優(yōu)勢
  ■ 使用更快的孔內(nèi)分析方式，更簡潔的單步提取法進(jìn)行DBS提取
  ■ 去除99.9%磷脂
  ■ 消除磷脂在LC色譜柱中的蓄積，提升方法穩(wěn)定性

沃特世解決方案
Xevo® TQ-S MS系統(tǒng)
ACQUITY UPLC®BEH C18柱
Ostro™ 96孔樣品制備板

引言
干血斑分析法（DBS）在醫(yī)藥行業(yè)正變得愈發(fā)重要。動物實(shí)驗(yàn)所帶來的經(jīng)濟(jì)及倫理道德方面的問題，以及在運(yùn)輸以及儲存生物樣品時所產(chǎn)生的高額費(fèi)用問題，都使得DBS分析法成為一種頗具吸引力的選擇。DBS分析法可取得較高的分析物回收率。然而，該技術(shù)在去除內(nèi)源性干擾方面收效甚微。以殘余磷脂（PLs）為主的干擾物是生物分析中遇到的主要問題。而LC/MS/MS系統(tǒng)中PLs的蓄積，則是引發(fā)基質(zhì)效應(yīng)的主要原因。在所有其他問題之中，基質(zhì)效應(yīng)會以無可預(yù)測的方式影響質(zhì)譜響應(yīng)值，降低分析方法穩(wěn)定性并增加其可變性。Ostro 96孔樣品制備板則可消除99%以上的PLs殘留。Ostro 96孔板可通過使用96孔制備板的形式進(jìn)一步簡化DBS萃取流程，同時提取分析物、去除磷脂、過濾干血斑紙片。DBS樣品可在孔內(nèi)萃取并稀釋直接進(jìn)樣到LC/MS/MS系統(tǒng)中。該創(chuàng)新方法能夠顯著降低樣品制備時間，并在萃取轉(zhuǎn)化、干燥、復(fù)溶過程中避免潛在的分析物流失。在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們同時應(yīng)用了傳統(tǒng)方法和Ostro 96孔樣品制備板方法，對含有利培酮、利培酮羥基化代謝物、9-OH利培酮及其內(nèi)標(biāo)氯氮平（圖1）的全血樣品進(jìn)行了萃取。 

實(shí)驗(yàn)部分
ACQUITY UPLC條件
色譜柱：  ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×50 mm，1.7 μm
流動相A：  0.1% NH4OH 水溶液
流動相B：  50/50 ACN/MeOH
流速：  0.6 mL/min
梯度： 

 時間         梯度模式         梯度線型
  (min)             %A    %B
  0.0                75    25           6
  2.0                0.5 99.5         6
  3.0               0.5 99.5         6
  3.1                 75 25            6
  3.5                 75   25            6
進(jìn)樣量：  40 μL
進(jìn)樣模式：  部分環(huán)進(jìn)樣
柱溫：  35 ℃
樣品溫度：  15 ℃
強(qiáng)洗針液：  60:40 ACN:IPA＋2% HCOOH
弱洗針液：  95/5 H2O/MeOH

沃特世Xevo TQ-S MS運(yùn)行條件，ESI+
毛細(xì)管電壓：  3.0 V
脫溶劑溫度：  550 ℃
錐孔氣流速：  150 L/Hr
脫溶劑氣流速： 1000 L/Hr
碰撞池壓力：  2.6×10(-3) mbar
MRM通道監(jiān)測，ESI+參見表1

樣品制備條件
將20 μL的全血樣品滴在未經(jīng)處理的Whatman DMPK-C血卡上。樣品隨后在室溫下干燥2小時。使用Harris 3 mm微打孔器取3 mm血斑，分別放置進(jìn)傳統(tǒng)型DBS萃取法所需的1.5 mL離心管和Ostro 96孔板孔中。傳統(tǒng)萃取方法在1.5 mL離心管中進(jìn)行，使用了250 μL含5%水的甲醇溶液，隨后樣品進(jìn)行1分鐘渦旋、1分鐘3000 g離心，并最終將萃取物轉(zhuǎn)移至96孔板上。使用Ostro 96孔板的萃取則采用單步孔內(nèi)萃取法。在Ostro 96孔板中添加3 mm干血斑（圖2）。以250 μL含5%水的甲醇溶液作為萃取溶液，渦旋操作1分鐘、真空操作5分鐘。兩種方法產(chǎn)生的洗脫液都用250 μL 的水進(jìn)行稀釋，然后進(jìn)樣到LC/MS/MS系統(tǒng)中。 

結(jié)果與討論
在正離子模式下進(jìn)行MS分析。鑒于DBS萃取物的直接進(jìn)樣通常會導(dǎo)致極稀釋的樣品，我們采用Xevo TQ-S以顯著提升系統(tǒng)的靈敏度。這同時也有助于直接進(jìn)樣，并避免了吹干、復(fù)溶過程中可能存在的問題。
針對每一種樣品制備方法，我們都比較了磷脂殘留量。為了達(dá)成這一目的，我們對單個試管萃取和使用Ostro PLR板孔內(nèi)萃取的DBS進(jìn)行了比對，對五種磷脂進(jìn)行了量化。與傳統(tǒng)型DBS分析法相比，Ostro板去除磷脂比例高達(dá)99.9%（圖3）。為能直觀展示殘余磷脂，傳統(tǒng)型DBS萃取法和使用Ostro的孔內(nèi)DBS萃取法所產(chǎn)生的五種不同磷脂的總離子流（TIC）如圖所示（圖4）。當(dāng)使用Ostro板時，磷脂殘留量幾乎可忽略不計(jì)，且無蓄積情況。而當(dāng)使用傳統(tǒng)型DBS法時，即便出于預(yù)防磷脂蓄積的目的，采用高比例有機(jī)溶劑進(jìn)行了1分鐘的清洗，磷脂殘余量依舊顯著，而且在整個過程中都有蓄積。我們進(jìn)行了半驗(yàn)證，計(jì)算QC樣品濃度不足預(yù)期值的15%，滿足法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。9-OH利培酮（圖6）及其母化合物L(fēng)LOQ在全血中都達(dá)到 0.05 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線在3個以上數(shù)量級呈線性，全血中的線性范圍從0.05 ng/mL到50 ng/mL（圖7）。

 結(jié)論
  ■ 簡便、單步的DBS樣品制備方法
  ■ 相較于傳統(tǒng)的DBS萃取技術(shù)，去除殘余磷脂含量高達(dá)99.9%
  ■ 采用Xevo TQ-S質(zhì)譜儀，獲得高靈敏度
  ■ 去除LC色譜柱中PLs的蓄積

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