慢病毒，（ Lentivirus ）載體是以 HIV-1 （人類免疫缺陷 I 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。慢病毒在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達 RNAi 的研究中。由于有些類型細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的 siRNA 半衰期短，體外合成慢病毒(RNAi)對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達 siRNA 的載體，然后轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄慢病毒(RNAi) 的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成 siRNA ，在長期穩(wěn)定表達載體的細胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達的作用。在所構(gòu)建的 慢病毒(RNAi) 表達載體中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ啟動子來指導(dǎo) RNA 合成的，這是因為 RNA 聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的 RNA 不會帶 poly A 尾。當(dāng) RNA 聚合酶Ⅲ遇到連續(xù) 4 個或 5 個 T 時，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 3' 端形成 1~4 個U 。 U6 和 H1 RNA 啟動子是兩種 RNA 聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 莖環(huán)結(jié)構(gòu)（ stem loop ）。在 siRNA 表達載體中，構(gòu)成慢病毒(RNAi)-siRNA 的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄，然后兩條鏈互補結(jié)合形成 siRNA ；也可由載體直接表達小發(fā)卡狀 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，慢病毒載體包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ啟動子和 4 ～ 5 T轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有 1~4 個 U 3 ' 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細胞內(nèi)進一步加工成 siRNA 。構(gòu)建慢病毒載體前通常要通過合成 siRNA 的方法，尋找高效的慢病毒(RNAi)siRNA ，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入 siRNA 表達載體。

慢病毒載體（ Lentiviral vector ）較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達 shRNA ，實現(xiàn)在多種類型的細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達降低的動物提供了可能性。

慢病毒表達載體包含了慢病毒載體構(gòu)建/包裝、轉(zhuǎn)染、慢病毒穩(wěn)定整合到目的細胞所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝 RNA 到重組的慢病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用慢病毒表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的慢病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用慢病毒感染宿主細胞，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應(yīng)分子。 

二、這一系統(tǒng)的目的，主要是為了解決以下問題：

1. 對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，慢病毒，感染能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為 RNAi，cDNA 克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。

2. 慢病毒，進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選；

3. 慢病毒，為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；

在細胞相關(guān)的實驗操作中，對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞，通過病毒介導(dǎo)的實驗?zāi)軌虼蟠筇岣呋�因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，以達到目的基因的高效瞬時表達。

三、慢病毒載體介紹

慢病毒，載體（ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因（RNAi ）導(dǎo)入動物和人的原代細胞或細胞系。慢病毒載體基因組是正鏈 RNA ，其基因組進入細胞后，在細胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為 DNA ，形成 DNA 整合前復(fù)合體，進入細胞核后， DNA0000 整合到細胞基因組中。整合后的 DNA 轉(zhuǎn)錄 mRNA ，回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產(chǎn)生， RNAi。

慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達或 RNAi 干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體，能有效感染并整合到非分裂細胞中。以上特性使（慢病毒載體）與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文獻研究表明，（慢病毒）載體介導(dǎo)的目的基因長期表達的組織或細胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、巨噬細胞等。

（慢病毒）載體不表達任何 HIV-1 蛋白，免疫原性低，在注射部位無細胞免疫反應(yīng)，體液免疫反應(yīng)也較低，不影響慢病毒病毒載體的第 2 次注射。

四、慢病毒載體的構(gòu)建

1. 構(gòu)建原理

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，但其基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除 gag、pol 和 env 這 3 個和單純逆轉(zhuǎn)錄病毒相似的結(jié)構(gòu)基因外，還包括 4 個輔助基因，vif、vpr、nef、vpu 和 2 個調(diào)節(jié)基因 tat 和 rev 。 HIV 21 是（慢病毒）中最具特征性的病毒，第一個慢病毒載體系統(tǒng)即以此病毒為基礎(chǔ)進行構(gòu)建的。慢病毒載體的構(gòu)建原理就是將 HIV 21 基因組中的順式作用元件 ( 如包裝信號、長末端重復(fù)序列 ) 和編碼反式作用蛋白的序列進行分離。載體系統(tǒng)包括包裝成分和載體成分：包裝成分由 HIV 21 基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能反式提供產(chǎn)生慢病毒顆粒所需的蛋白；慢病毒載體成分與包裝成分互補，含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的 HIV 21順式作用序列。同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒 (RCV ) 的可能性，將包裝成分的 5 ′ LTR 換成巨細胞病毒 (CMV ) 立即早期啟動子，3 ′ LTR 換成 SV 40 polyA 位點等。將包裝成分分別構(gòu)建在兩個質(zhì)粒上，即一個表達 gag 和 pol、另一個表達 env 。根據(jù)這個原理，Naldini 和 Kafri 等構(gòu)建了三質(zhì)粒表達系統(tǒng)。