摘要

目的：探討嚴(yán)重心理應(yīng)激是否可引發(fā)實驗大鼠較長時間的情緒喚醒水平障礙，以建立較理想的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動物模型。

 

方法：實驗于2004- 01 /2005- 06 在解放軍成都軍區(qū)成都總醫(yī)院完成。選擇雄性Wistar 大鼠135只, 成組設(shè)計隨機分為捕食應(yīng)激組75 只和正常對照組60 只。先將大鼠放入捕食應(yīng)激實驗箱的小籠中，再將一只饑餓的貓放入實驗箱中，使貓與大鼠無生理傷害性接觸，致大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動及因驚嚇?biāo)�致呼吸急促而快速鼻翼煽�?～8 min；正常對照組大鼠除不接觸貓外，其他處理程序相同。并通過大鼠運動活性、探究行為、拒俘反應(yīng)性和高架十字迷宮實驗觀測應(yīng)激后4個月內(nèi)實驗大鼠情緒喚醒水平改變，同時以Morris 水迷宮法檢測其空間學(xué)習(xí)和記憶能力。采用SPSS 9.0 軟件進行單因素或雙因素方差分析，以及各組均數(shù)的SN-K法和Tamhane’s T2 法檢驗。

 

結(jié)果：參與實驗大鼠135只在實驗過程中無死亡，均進入結(jié)果分析。①與正常對照組相比，捕食應(yīng)激后1個月內(nèi)應(yīng)激大鼠曠場爬越行為明顯減少[（71.5±13.5），（96.8±18.4）分，P < 0.05]；4 個月時后肢性站立仍明顯減少[（11.4±2.1），（17.9±3.3）分，P < 0.05]。②與正常對照組相比，高架十字迷宮實驗中應(yīng)激大鼠進入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比均明顯降低[(4.8±0.9)%，(20.7±3.7)%，P < 0.01]；[(0.9±0.2)%，(6.6±1.2)%，P < 0.01]。③與正常對照組相比，拒俘反應(yīng)性則在應(yīng)激后2 個月內(nèi)明顯增加[（2.4±0.5），（1.5±0.4）分，P < 0.05]。④與正常對照組相比，捕食應(yīng)激后第1 天應(yīng)激大鼠在Morris 水迷宮空間覓向訓(xùn)練中潛伏期明顯延長訓(xùn)練15 次時為(32±6)，(17±3) s，P < 0.05]，在空間定向能力測試時應(yīng)激大鼠水迷宮的4個象限中無目的漫游所花費時間百分比差異無顯著性意義。應(yīng)激后2 周時大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力測試無明顯改變。

 

結(jié)論:單純捕食應(yīng)激成功誘發(fā)了實驗大鼠持續(xù)性運動活性減少、探究行為受抑、警覺水平過高、焦慮不安狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力下降、驚恐逃避反應(yīng)等多種情緒喚醒障礙，以及短期空間學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知能力受損表現(xiàn)，具有與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙相似的致病因素與過程，可基本模擬其主要臨床表現(xiàn)。

 

主題詞：應(yīng)激障礙，創(chuàng)傷后；捕食應(yīng)激；情緒喚醒；動物模型

 

1 材料和方法

 

設(shè)計：隨機對照動物實驗。

單位：解放軍成都軍區(qū)成都總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。

材料：實驗于2004- 01 /2005- 06 在解放軍成都軍區(qū)成都總醫(yī)院完成。選擇雄性Wistar 大鼠135 只，實驗起始體質(zhì)量（185±9）g，由解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供(許可證號：scxk-（軍）2002008)。12 h 光亮/黑暗條件、22～25 ℃ 環(huán)境溫度，分隔喂養(yǎng)。成組設(shè)計隨機數(shù)字表法分為捕食應(yīng)激組75 只及正常對照組60 只。

 

儀器：按文獻自制捕食應(yīng)激實驗箱（1 m×1 m×1 m 鐵絲籠，中間放置20 cm×15 cm×15 cm 小鐵絲籠，便于實驗時將大鼠放入其中）。按文獻[5, 6]自制曠場行為觀察箱(60 cm×60 cm×60 cm 的無頂木盒，箱底用墨線分為36 個等份小方格。用于大鼠情緒喚醒水平檢測)。按文獻[7]制備高架十字迷宮(木質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括2 個50 cm×10 cm 的相對開臂和2 個50 cm×10 cm ×40 cm的相對閉臂，閉臂的上部是敞開的。迷宮中央有10 cm×10 cm的開闊部。迷宮離地面50 cm。用于評價大鼠焦慮樣行為改變)。按文獻[8]制備Morris水迷宮(直徑1.2 m、高0.5 m 的圓桶，劃為4 個象限（按順時針方向定義為A、B、C、D），盛水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，使水成為不透明的乳白色，水溫控制于22～25 ℃。將直徑11 cm平臺固定于某一象限（本實驗中置于A 象限），平臺在水平面下1 cm。用于空間學(xué)習(xí)和記憶能力觀察)。

 

設(shè)計、實施、評估者：設(shè)計為第一作者，資料收集為第一、二、三作者，實施為第一、二、三、四作者，評估為第一、五作者。實驗實施前所有參與者均經(jīng)過相關(guān)專業(yè)統(tǒng)一培訓(xùn)。

 

方法：

模型制備：先將大鼠放入捕食應(yīng)激實驗箱的小籠中，再將1只饑餓的貓放入實驗箱中，使貓與大鼠無生理傷害性接觸，致大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動及因驚嚇?biāo)�致呼吸急促而快速鼻翼煽�?～8 min，以確保實驗大鼠相似的應(yīng)激強度及穩(wěn)定的應(yīng)激效應(yīng)。正常對照組大鼠除不接觸貓外，其他處理程序相同。

 

情感行為觀察：于捕食應(yīng)激后1，14 d，1，2 和4 個月時分別取正常對照組及捕食應(yīng)激組大鼠各12、15只，觀察其情感行為改變：①大鼠運動活性：將大鼠輕輕放入曠場行為觀察箱中央小方格內(nèi)，觀測5 min 內(nèi)動物的活動情況。計分標(biāo)準(zhǔn)：大鼠1 /2 以上身體從所在方格進入相鄰方格，即爬越1 次計1 分，所得總分用于評價其運動活性改變。②探究行為：方法同上，觀察5 min內(nèi)大鼠后肢性站立計分改變。計分標(biāo)準(zhǔn)：后肢性站立1次計1分，總分用于評價其探究行為改變。③拒俘反應(yīng)性：以動物從未接觸過的手套輕抓大鼠，觀察其反應(yīng)。記分標(biāo)準(zhǔn)：0 很容易抓取動物；1 尖叫或回避；2 尖叫并回避；3 逃脫；4 逃脫并尖叫；5 咬或試圖撕咬手套；6主動躍起攻擊；以此評價動物恐懼與沖突素質(zhì)特征改變[6]。④高架十字迷宮實驗：將大鼠置于迷宮中央，頭朝閉臂。分別記錄5 min 內(nèi)大鼠進入開臂和閉臂的次數(shù)和在兩臂滯留時間（以四肢全部入臂或出臂為準(zhǔn)），計算大鼠進入開臂的次數(shù)和在開臂滯留時間分別占總次數(shù)(進入開臂與閉臂次數(shù)之和）及總時間（在開臂與閉臂滯留時間之和）的百分比，以此為評價焦慮指標(biāo)。

 

空間學(xué)習(xí)和記憶能力觀察:采用Morris 水迷宮法[8]，觀察捕食應(yīng)激后第1 天，2 周時空間學(xué)習(xí)和記憶能力的改變。第1，2 天為空間覓向訓(xùn)練：第1 天訓(xùn)練9 次，2 min /次，記錄大鼠從不同象限入水至發(fā)現(xiàn)并爬上平臺的時間為訓(xùn)練潛伏期，每3 次的均值作為平均訓(xùn)練潛伏期；第2 天重復(fù)進行6 次訓(xùn)練；比較所得的5 個平均訓(xùn)練潛伏期變化以分析動物獲取空間信息的能力。第3 天進行空間定向能力測試：先將平臺移去，再將大鼠放入水中2 min，記錄它在四個象限中停留時間的百分比，以判斷動物記憶儲存及提取再現(xiàn)能力。

 

主要觀察指標(biāo)：大鼠爬越行為、后肢性站立、拒俘反應(yīng)性、高架十字迷宮開臂次數(shù)與開臂時間、Morris 水迷宮平均訓(xùn)練潛伏期及不同象限停留時間百分比。

 

統(tǒng)計學(xué)分析：由成都軍區(qū)成都總醫(yī)院信息科統(tǒng)計室采用SPSS 9.0 軟件進行單因素或雙因素方差分析，以及各組均數(shù)的S- N- K法（用于方差齊性的大鼠爬越行為、拒俘反應(yīng)及開臂次數(shù)百分比的比較）和Tamhane’sT2法檢驗（用于方差不齊性的大鼠后肢性站立、開臂時間百分比及空間學(xué)習(xí)和記憶能力改變的比較）。

 

2 結(jié)果

 

2.1 實驗動物數(shù)量分析參與實驗大鼠135只在實驗過程中無死亡，均進入結(jié)果分析。

2.2 大鼠捕食應(yīng)激后不同時間情感行為觀察結(jié)果

2.2.1 大鼠捕食應(yīng)激后不同時間曠場行為改變和高架十字迷宮行為改變結(jié)果。

表1 顯示，捕食應(yīng)激大鼠應(yīng)激后1個月內(nèi)曠場爬越行為明顯減少，顯示其運動活性降低，之后漸恢復(fù)正常；而4個月時后肢性站立仍顯著減少，表明其探究行為明顯降低。捕食應(yīng)激后4 個月內(nèi)，應(yīng)激大鼠進入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比均明顯降低，并于應(yīng)激后1 個月時稍有恢復(fù)，但2個月后則進一步降低。

2.2.2 大鼠捕食應(yīng)激后不同時間拒俘反應(yīng)性結(jié)果見表2。大鼠拒俘反應(yīng)性在應(yīng)激后2個月內(nèi)明顯增強。

 

3 討論

 

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙臨床表現(xiàn)多樣，包括反復(fù)重現(xiàn)創(chuàng)傷性體驗癥狀，情感麻木與回避癥狀，警覺過強所致持續(xù)性焦慮、驚恐逃避反應(yīng)及易激惹癥狀等癥候群。作者的前期工作分別建立了海馬驚厥閾下電刺激和大鼠加強捕食應(yīng)激兩種創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動物模型。雖然二者均可誘發(fā)實驗大鼠造型后1個月內(nèi)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙樣行為異常，但由于前者很難排除電刺激等影響因素的作用，且與創(chuàng)傷后應(yīng)急障礙的致病因素亦有較大差異；而后者采用了捕食應(yīng)激與再次環(huán)境刺激相結(jié)合的方法，很難排除2次應(yīng)激效應(yīng)的影響；同時，兩種模型觀察時間有限，且所用行為學(xué)研究方法的定量、定性分析不足，難以排除研究者主觀因素的影響；因此，有必要進一步改進應(yīng)激模式、控制應(yīng)激強度，以誘發(fā)實驗大鼠更長時程的應(yīng)激相關(guān)情感行為異常，并定量分析相關(guān)情緒喚醒障礙的性質(zhì)。

 

鑒于應(yīng)激因素與強度，以及受害者當(dāng)時的極度無助感在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)病中有重要意義，利用動物食物鏈中特殊的捕食行為，模擬與之相似的致病因素和過程。同時，通過反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，捕食應(yīng)激4～9 min即可引發(fā)大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動，以及因驚嚇?biāo)�致呼吸急促而快速鼻翼煽動，而持續(xù)這種驚嚇狀態(tài)6～8 min（即總體應(yīng)激時間在11～17 min）時，可確保實驗大鼠基本相似的應(yīng)激強度及穩(wěn)定的應(yīng)激效應(yīng)；更有趣的是，此時的應(yīng)激效應(yīng)亦可能最佳，并由此引發(fā)了實驗大鼠在4 個月的觀察時間內(nèi)存在明顯的情感行為障礙；而應(yīng)激不足或過強、持續(xù)時間過短或過長，似均難以達到類似的效應(yīng)，但應(yīng)激方式和強度與應(yīng)激相關(guān)情感行為異常間的關(guān)系尚不能確定，有待進一步探討。

 

曠場行為觀察是檢測實驗動物情緒喚醒水平的一種重要方法。動物初入陌生環(huán)境可出現(xiàn)明顯的防護性情感反應(yīng)，這對于量化分析實驗動物的警覺水平、焦灼狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力等有重要意義。實驗結(jié)果顯示，捕食應(yīng)激大鼠應(yīng)激后1個月內(nèi)曠場爬越行為明顯減少，提示其新環(huán)境中運動活性顯著降低；拒俘反應(yīng)性則在應(yīng)激后2個月內(nèi)顯著增強，顯示其受驚嚇程度嚴(yán)重、沖突特性增強、易激惹、掙扎行為明顯；而4個月時后肢性站立仍顯著減少，表明其挫折感明顯、探究行為顯著受抑。由實驗結(jié)果可見，捕食應(yīng)激可致實驗大鼠在新環(huán)境中的警覺水平明顯增高、易激惹、適應(yīng)能力顯著下降，在應(yīng)激刺激后較長時間內(nèi)一直處于驚恐逃避情感反應(yīng)中。

 

高架十字迷宮試驗則是利用動物對新異環(huán)境的探究特性，以及對高懸敞開臂的恐懼感而形成的矛盾沖突狀態(tài)來評價實驗動物焦慮素質(zhì)特征的。實驗結(jié)果顯示，捕食應(yīng)激后4個月內(nèi)，應(yīng)激大鼠進入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比均明顯降低，提示捕食應(yīng)激對大鼠有明顯的長時間的致焦慮效應(yīng)；有趣的是，實驗大鼠焦慮情緒于應(yīng)激后2 周內(nèi)進行性加重，1個月時有所緩解，但2個月后則再次進一步加重，顯示嚴(yán)重心理應(yīng)激所致實驗大鼠情緒喚醒障礙可能主要以焦慮相關(guān)行為為特征，與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者極為相似，具體原因尚待進一步探討。

 

Morris 水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶模型，能較準(zhǔn)確地反映動物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。在Morris 水迷宮的空間覓向訓(xùn)練期，捕食應(yīng)激后1 d 應(yīng)激大鼠較正常對照組花費更多的時間以找尋平臺，顯示其學(xué)習(xí)和記憶的獲得與鞏固過程受到影響；而在空間定向能力測試期，應(yīng)激大鼠空間定向能力亦明顯受損，顯示捕食應(yīng)激可導(dǎo)致實驗動物記憶過程的不穩(wěn)定性，且對己儲存記憶的讀出或提取過程可能也有一定影響。而實驗后2周時兩組動物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力并無明顯差異，提示嚴(yán)重心理應(yīng)激只引發(fā)了實驗動物短期的學(xué)習(xí)和記憶能力受損，與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者存在的短暫認(rèn)知功能受損頗為相似。