Mary E. Lame、Erin E. Chambers和Kenneth J. Fountain
沃特世公司（美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德）

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
■使用CORTECS™ UPLC®色譜柱有利于獲得較窄的峰寬、改善靈敏度和分離度，并消除基質(zhì)干擾
■ 采用Oasis®WCX（一種混合型吸附劑）的SPE方法降低了基質(zhì)干擾并提高了血漿中緩激肽提取的選擇性
■ Oasis μElution96孔板可濃縮樣品，并在最大程度上減少肽損失，使血漿中緩激肽的檢測(cè)限達(dá)到5 pg/mL
■ 選擇性高的快速SPE提取（<30 分鐘）省去了耗時(shí)的免疫親和純化步驟
■ Xevo®TQ-S MS可實(shí)現(xiàn)與免疫檢測(cè)方法相匹配的高靈敏度，但與后者相比更加省時(shí)省力
■ 與傳統(tǒng)LBA方法相比更為準(zhǔn)確精密
■ 分析速度快，只需3.5分鐘，大大提高了工作效率

沃特世解決方法
ACQUITY UPLC®系統(tǒng)
Xevo TQ-S質(zhì)譜儀
CORTECS UPLC C₁₈色譜柱
Oasis WCX 96孔µElution提取板
ACQUITY®96孔收集板

關(guān)鍵詞
生物分析，Oasis，樣品制備，肽定量，緩激肽，UPLC，CORTECS，血漿

簡(jiǎn)介
緩激肽是一種含有9種氨基酸的生理和藥理活性肽，由蛋白質(zhì)的激肽基團(tuán)衍生而來(lái)（圖1）。激肽是可以促使血管舒張、血管通透性增強(qiáng)、一氧化氮釋放和花生四烯酸流動(dòng)的效應(yīng)因子。它是血壓、腎功能和心臟功能的重要調(diào)節(jié)因子，還參與炎癥反應(yīng)¹。緩激肽可引起血管擴(kuò)張，從而導(dǎo)致血壓降低。因此，對(duì)這種激素肽的變化進(jìn)行高靈敏度、高選擇性和高準(zhǔn)確度地定量，并將其作為疾病進(jìn)展或藥物治療的評(píng)估指標(biāo)，將會(huì)極為有利。盡管以往都是通過(guò)配體結(jié)合試驗(yàn)（LBAs）對(duì)生物制劑進(jìn)行定量分析，但在過(guò)去幾年中利用LC-MS/MS分析大分子已成為一種趨勢(shì)。這在某種程度上是因?yàn)長(zhǎng)BAs產(chǎn)生顯著的交叉反應(yīng)問(wèn)題并且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。LC-MS/MS具有多種優(yōu)勢(shì)，例如開(kāi)發(fā)時(shí)間更短、準(zhǔn)確度和精度更高、可重復(fù)進(jìn)樣，并且容易區(qū)分相似度很高的類(lèi)似物、代謝物或內(nèi)源性干擾物。常見(jiàn)的肽通常難以通過(guò)LC-MS/MS進(jìn)行分析，這是因?yàn)槠洳灰纂x子化以及不易產(chǎn)生理想的碎片離子而導(dǎo)致MS靈敏度較低，從而使得LC和樣品制備方法開(kāi)發(fā)非常困難。由于緩激肽在血漿中的濃度低至pg/mL水平且代謝速度快，在采血和樣品制備過(guò)程中還可通過(guò)蛋白水解人為生成，因此對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量相當(dāng)困難。

本研究采用了專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的血液收集技術(shù)以防止體外緩激肽的形成，并且利用混合型固相萃取（SPE）和高效實(shí)心核顆粒色譜柱，最大限度降低并消除基質(zhì)干擾的同時(shí)提高定量分析的靈敏度。

簡(jiǎn)介

方法條件
系統(tǒng)：ACQUITY UPLC
色譜柱：CORTECS UPLC C₁₈ 1.6 µm，2.1×50mm
流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液
流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液
梯度：見(jiàn)表1
柱溫：35攝氏度
樣品溫度：15攝氏度
進(jìn)樣體積：10 µL
總運(yùn)行時(shí)間：3.5 min
收集板：Waters 1 mL ACQUITY收集板

MS條件
MS系統(tǒng)：Xevo TQ-S
電離模式：ESI+
毛細(xì)管電壓：3.0 kV
脫溶劑氣溫度：500攝氏度
錐孔氣流速：150 L/h
脫溶劑氣流速：1000 L/h
碰撞室壓力：3.58×10（-3）mbar
碰撞能量：按組分優(yōu)化，見(jiàn)表2
錐孔電壓：按組分優(yōu)化，見(jiàn)表2

數(shù)據(jù)管理
色譜軟件：UNIFI®1.6
定量軟件：UNIFI 1.6

數(shù)據(jù)管理
樣品預(yù)處理

將10 μL內(nèi)標(biāo)（IS）賴(lài)氨酸 -（脫-精氨酸9）- 緩激肽（10 ng/mL）加入200 μL人血漿中并混合。然后使用5% NH4OH水溶液對(duì)樣品進(jìn)行1:1稀釋并混合。

使用Oasis WCX提取樣品
根據(jù)圖2所示方案提取預(yù)處理的血漿樣品。所有溶液按體積計(jì)。對(duì)μElution板上放置樣品的孔實(shí)施全部提取步驟。

結(jié)果與討論

質(zhì)譜分析
在m/z 531和m/z 354觀察到緩激肽的2+和3+母離子。緩激肽（圖A）和IS（圖B）的3+母離子的典型MS/MS譜圖如圖3所示。在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，記錄了一些不同的多電荷母離子和碎片離子。最終使用了緩激肽和IS的3+母離子，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨�質(zhì)中強(qiáng)度最高且選擇性最佳。選擇m/z 419.18y31+的碎片離子作為緩激肽定量分析的主要碎片離子。選取3+母離子和m/z 408.18 b41+碎片離子用于確證。對(duì)于IS，選擇了m/z 344.94的3+母離子和m/z 386.03 b72+碎片離子。最佳MS條件如圖2所示。盡管許多肽可以生成小于m/z 200的較強(qiáng)碎片離子，但在提取樣品中這些離子（通常為亞胺離子）由于缺乏特異性，會(huì)導(dǎo)致高背景噪音。在此檢測(cè)中，采用m/z值大于其母離子的高特異性b或y碎片離子顯著提高了特異性，便于使用更為簡(jiǎn)單的LC和SPE方法。

UPLC分離
與小分子不同，肽在全多孔顆粒中的傳質(zhì)性能較差。因此，在生物分析研究常用的較高流速下，使用實(shí)心核顆粒填充的色譜柱可獲得更清晰的峰形^2,3。與全多孔顆粒色譜柱相比，在使用CORTECS UPLC C₁₈色譜柱時(shí)，緩激肽所得到的峰寬更窄、拖尾現(xiàn)象減少、峰高和峰面積更大。利用CORTECS UPLC C₁₈色譜柱得到的緩激肽和IS的峰寬為2.5-3.0秒，而在全多孔色譜柱中峰寬為4秒。使用CORTECS UPLC C₁₈色譜柱得到的緩激肽和IS的典型色譜圖如圖4所示。

樣品制備
將人血漿收集到含有EDTA和蛋白酶抑制劑的試管中，以防止體外形成緩激肽。使用Oasis WCX（一種混合型吸附劑）進(jìn)行SPE提取，提高提取的選擇性。此吸附劑依靠反相和離子交換保留機(jī)制將復(fù)雜血漿樣品中的緩激肽與其它高豐度多肽選擇性地分離開(kāi)來(lái)。Oasis μElution96孔提取板可在無(wú)需蒸發(fā)和復(fù)溶的條件下富集樣品。這不僅節(jié)省了時(shí)間，還減少了由于蒸發(fā)過(guò)程中收集板壁的吸附而導(dǎo)致的肽損失。預(yù)處理和清洗步驟的優(yōu)化對(duì)于在樣品預(yù)處理和SPE提取中完全回收緩激肽至關(guān)重要。使用酸或堿對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理可降低粘度并增加與吸附劑的接觸時(shí)間，有利于抑制蛋白質(zhì)結(jié)合，還可以通過(guò)離子交換功能使肽在SPE設(shè)備中得到更好的保留。在最初的方法開(kāi)發(fā)中，通過(guò)用酸預(yù)處理血漿獲得了約80%的回收率。由于緩激肽是一種堿性的極性肽，其PI值為12.0，HPLC指數(shù)為47.8，因此懷疑它在最初的上樣步驟中發(fā)生了部分洗脫。當(dāng)使用堿進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，回收率增加至約90%，這有利于在上樣步驟中通過(guò)離子交換改善緩激肽的初始保留性能。將清洗步驟2中的乙腈溶液由20%變?yōu)?0%，消除了清洗過(guò)程中緩激肽的穿透現(xiàn)象，并使回收率提升至100%。在上樣前對(duì)血漿進(jìn)行堿預(yù)處理的優(yōu)化SPE方案與采用10%乙腈溶液的優(yōu)化清洗步驟相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了緩激肽的完全回收，且基質(zhì)效應(yīng)小于10%。此外，由于UPLC分離在反相色譜進(jìn)行，因此利用離子交換實(shí)現(xiàn)的肽分離為整個(gè)方法賦予了正交性。

線性、準(zhǔn)確度和精度
為了生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以下最終濃度的緩激肽對(duì)人血漿進(jìn)行強(qiáng)化：5、20、30、60、100、200、400、600、1000、2000、6000和10000 pg/mL。在人血漿中制備以下濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品：25、80、250、800和5000 pg/mL。使用賴(lài)氨酸 -（脫-精氨酸9）- 緩激肽（最終濃度為0.5 ng/mL）作為緩激肽的內(nèi)標(biāo)（IS）。計(jì)算分析物峰面積與IS峰之間的峰面積比（PAR）。使用校準(zhǔn)樣品的PAR并應(yīng)用單一濃度（1/x）加權(quán)線性回歸模型構(gòu)建人血漿樣品的校準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)校準(zhǔn)曲線，通過(guò)PAR值計(jì)算出所有QC樣品的濃度。由于存在內(nèi)源性緩激肽，因此采用標(biāo)準(zhǔn)品加入法。通過(guò)計(jì)算x軸截距確定對(duì)照血漿樣品中緩激肽的平均基底濃度。然后，將緩激肽的基底濃度加入到所有標(biāo)曲濃度和QC濃度，以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。使用1/x回歸，緩激肽所得曲線呈線性，R²值>0.99。表3所示為標(biāo)準(zhǔn)曲線性能匯總。QC分析結(jié)果示于表4中，內(nèi)源性緩激肽和QC的典型色譜圖如圖5所示。所有濃度的QC樣品都表現(xiàn)出極好的準(zhǔn)確度和精密度，滿(mǎn)足了有關(guān)LC-MS/MS檢測(cè)的生物分析方法驗(yàn)證最佳實(shí)踐白皮書(shū)中建議的FDA可接受標(biāo)準(zhǔn)^4,5。人血漿中緩激肽的平均內(nèi)源性基底濃度測(cè)得為79 pg/mL，SD和CV%分別為4.4和5.5。以上數(shù)據(jù)證實(shí)了這是一種穩(wěn)定且可重現(xiàn)的方法。

預(yù)分析收集和處理的重要性
對(duì)血漿中的緩激肽進(jìn)行準(zhǔn)確定量十分困難，因?yàn)榫徏る目梢栽诓裳�和樣品制備中�?jīng)蛋白水解過(guò)程而生成^1,6,7。本研究特別注重血液收集方案，通過(guò)添加蛋白酶抑制劑以防止體外緩激肽的形成。在圖6中，A圖和B圖顯示出，如果采用同一供體和相同的收集方案，將血液收集到分別添加和未添加蛋白酶抑制劑的EDTA試管中，緩激肽的濃度從90 pg/mL升至250 pg/mL。通過(guò)使用來(lái)自供應(yīng)商的另外兩個(gè)供體的未指定樣品收集方案，緩激肽的人為形成得到進(jìn)一步證實(shí)，如圖6（圖C和圖D）所示。在上述情況下，將血液樣品收集到不含蛋白酶抑制劑的EDTA試管中，濃度達(dá)到了較高的ng/mL水平。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了合適的樣品收集方式對(duì)于準(zhǔn)確定量?jī)?nèi)源性緩激肽血漿濃度的必要性。

結(jié)論
本研究開(kāi)發(fā)了一種用于提取人血漿中緩激肽的混合模式SPE提取方法。μElution SPE提取板消除了蒸發(fā)操作需求，并且利用非特異性結(jié)合和樣品濃縮而大大降低了損失的可能性。通過(guò)一種快速、簡(jiǎn)單、分析級(jí)的LC方法將緩激肽與相似度很高的內(nèi)源性干擾物分離開(kāi)來(lái)，LC總運(yùn)行時(shí)間僅為3.5分鐘。與傳統(tǒng)的C₁₈全多孔色譜柱相比，CORTECS UPLC C₁₈實(shí)心核顆粒色譜柱改善了峰形，提高了緩激肽檢測(cè)的靈敏度。CORTECS UPLC C₁₈色譜柱、混合型弱陽(yáng)離子交換SPE以及m/z較高的b或y MS碎片離子的聯(lián)合使用提供了理想的選擇性和靈敏度水平，從而實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確定量并從200 μL血漿中區(qū)分緩激肽濃度細(xì)微差異。標(biāo)準(zhǔn)曲線在5-10000 pg/mL的范圍內(nèi)準(zhǔn)確精密。在高于基底濃度的情況下可精確定量的緩激肽最低濃度為5 pg/mL。所有濃度的QC樣品均符合FDA法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)^4,5，平均準(zhǔn)確度范圍為99.8-106.8，平均CV%為0.5-5.5。以上數(shù)據(jù)證實(shí)了這是一種準(zhǔn)確且可重現(xiàn)的方法。本研究還證實(shí)了采用合適的蛋白酶抑制劑樣品收集方式對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)定緩激肽內(nèi)源性濃度的重要性。此外，如果需要執(zhí)行進(jìn)一步驗(yàn)證，本方法在通過(guò)LC-MS/MS對(duì)PK和臨床研究的患者樣品進(jìn)行高靈敏度的緩激肽定量方面也表現(xiàn)出巨大的潛力。

參考文獻(xiàn)
1. Murphey LJ, Hachey DL, JA. Oates JA, Morrow JD, and Brown NJ. Metabolism of Bradykinin In Vivo in Humans: Identification of BK1-5 as a Stable Plasma Peptide Metabolite J Pharmacol Exp T her July 1, 2000 294:263-269
2. Wagner BM, Schuster SA, Boyes BE, Kirkland JJ. Superficially porous silica particles with wide pores for biomacromolecular separations. Journal of Chromatography A. 2012; 1264(0): 22-30
3. Kirkland JJ, Schuster SA, Johnson WL, boyes BE. Fused-Core Particle Technology in High-Performance Liquid Chromatography; An Overview. Journal of Pharmaceutical Analysis.
4. Viswanathan CT, Bansal S, Booth B, DeStefano AJ, Rose MJ, Sailstad J, Shah VP, Skelly JP, Swann PG, Weiner R, Quantitative bioanalytical methods validation and implementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays, Pharm. Res., 24 (2007) 1962-1973.
5. Bansal S, DeStefano A, Key elements of bioanalytical method validation for small molecules, AAPS J., 9 (2007) E109-114.
6. Cugno M, Agostoni P, Brunner HR, Gardinali M, Agostoni A, Nussberger. Plasma bradykinin levels in human chronic congestive heart failure J. Clin Sci. (Lond). 2000 Nov; 99(5):461-6.
7. Nussberger J, Cugno M, Amstutz C, Cicardi M, Pellacani A, Agostoni A. Plasma bradykinin in angio-oedema. Lancet. 1998 Jun 6; 351(9117):1693-7.

致謝
感謝Jeffrey Widdos和Biological Specialty Corporation為本研究所用人血漿的收集提供的服務(wù)和協(xié)助。