Lisa J Calton, Scott D Gillingwater, Gareth W Hammond, Donald P Cooper
沃特世公司臨床業(yè)務(wù)部(英國(guó)曼徹斯特阿特拉斯商業(yè)園)

簡(jiǎn)介
臨床研究表明：維生素D缺乏癥在世界許多地區(qū)的成人和兒童中非常普遍。除了眾所周知的影響(例如與鈣吸收障礙相關(guān)的佝僂病、骨質(zhì)疏松癥和骨軟化癥)外，現(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)表明維生素D缺乏癥還會(huì)增加罹患某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，并對(duì)許多其它疾病有一定的影響^1,2。維生素D具有兩種存在形式，一種是皮膚暴露于日光下所產(chǎn)生的維生素D₃(D3) ，另一種則是存在于多種補(bǔ)品中的植物衍生物—維生素D₂(D2)。維生素D在肝臟中代謝形成25-羥基維生素D[25OHD]，后者在腎臟中進(jìn)一步代謝形成活性代謝物1,25-二羥基維生素D。25OHD的水平被認(rèn)為是評(píng)價(jià)體內(nèi)維生素D水平的最佳臨床指標(biāo)³。維生素D水平的評(píng)估對(duì)于維生素D缺乏癥的診斷和補(bǔ)充治療的監(jiān)測(cè)非常重要。最近，相對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)、免疫檢測(cè)和HPLC法等其它方法，利用LC/MS/MS方法定量分析25OHD2和25OHD3在提高檢測(cè)質(zhì)量和降低成本方面，更加受到人們的青睞。免疫檢測(cè)的主要問(wèn)題是無(wú)法區(qū)分25OHD2和25OHD3，還需依靠抗體與25OHD2的交叉反應(yīng)才能測(cè)定25OHD的總濃度 。如果該交叉反應(yīng)低于100%，那么D2治療可能無(wú)法得到準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)⁴。

圖1. 沃特世ACQUITY UPLC/TQD的系統(tǒng)配置

實(shí)驗(yàn)
將Waters® ACQUITY® 串聯(lián)四極桿檢測(cè)器(TQD)與ACQUITY UPLC®聯(lián)用以進(jìn)行各項(xiàng)分析。完整的系統(tǒng)配置如圖1所示。儀器通過(guò)MassLynx® 4.1軟件在電噴霧正離子模式下運(yùn)行，并采用QuanLynx^TM應(yīng)用軟件自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對(duì)錐孔電壓進(jìn)行優(yōu)化，使得進(jìn)入離子源的母離子的豐度最大化，并通過(guò)第一級(jí)四極桿選擇相應(yīng)的母離子進(jìn)入碰撞池。利用氬氣和碰撞能量促使碰撞誘導(dǎo)解離，生成特征性產(chǎn)物離子。利用此方法建立特異的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM) ，實(shí)驗(yàn)如表1所示。

LC條件
LC系統(tǒng)： Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH C₈, 2.1 x 50mm, 1.7μm
柱溫：   45 ˚C
流速：   400μL/min
流動(dòng)相A： 2 mM醋酸銨+0.1%甲酸的水溶液
流動(dòng)相B： 2 mM醋酸銨+0.1%甲酸的甲醇溶液
梯度： 流動(dòng)相B在73%保持2 min，在1.5 min內(nèi)從73%增加至98% 

MS條件
MS系統(tǒng)： Waters ACQUITY TQD
電離模式： ESI+ 
毛細(xì)管電壓： 2.5kV
錐孔電壓： 24V
脫溶劑氣溫度：400˚C  
脫溶劑氣流量：900L/h
源溫度： 120˚C
碰撞氣流速: 7.10 x 10^-3mbar

校準(zhǔn)品和QC標(biāo)準(zhǔn)品
按照各個(gè)生產(chǎn)廠家的說(shuō)明制備單一濃度的校準(zhǔn)品和雙濃度水平的QC標(biāo)準(zhǔn)品(Chromsystem，德國(guó)慕尼黑)。通過(guò)混合人血清并加入已知濃度的25OHD2和25OHD3，制備低濃度QC標(biāo)準(zhǔn)品溶液。低、中和高濃度QC樣品中25OHD2的最終濃度分別為19、27和84ng/mL，25OHD3的最終濃度則分別為13、29和89ng/mL。使用哺乳動(dòng)物血清制備校準(zhǔn)品用以線性評(píng)估，其中25OHD2和25OHD3的濃度范圍為1-100ng/mL。在264 nm下檢測(cè)儲(chǔ)備液，然后將其調(diào)整至最終濃度。 

樣品制備
吸取血清(150μL)至2mL微量離心管(Anachem)中，加入10μL內(nèi)標(biāo)(250ng/mL六氘代25OHD3，合成AS，以80%甲醇/20% IPA為溶劑) ，渦旋混合(10s)。加入0.2 M ZnSO₄溶液(150μL)并渦旋混合(10s)以增強(qiáng)反應(yīng) 。加入甲醇 (300μL)并混合(10s)，以沉淀血清中存在的蛋白質(zhì)。加入己烷(750μL)，用以提取25OHD。混合30s，然后將樣品在13000rpm下離心5 min。移取己烷層并將其置于沃特世最大回收樣品瓶中，在50˚C的氮?dú)庀抡舭l(fā)至干。將樣品復(fù)溶于75μL70%甲醇水溶液中，借助ACQUITY樣品管理器的預(yù)加載功能將20μL樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS系統(tǒng)中，進(jìn)樣間隔時(shí)間為6 min。

離子抑制
將人血清樣品混合低濃度的25OHD2和25OHD3并使用柱后添加對(duì)其進(jìn)行分析，以100ng/mL濃度和10μL/min流速通過(guò)ACQUITY TQD集成式樣品流路。 

結(jié)果線性
使用QuanLynx定量軟件和ApexTrack^TM積分算法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理 。以2.5-100ng/mL的濃度范圍內(nèi)向血清中加入已知濃度的25OHD2和25OHD3，對(duì)分析方法的線性進(jìn)行考察。25OHD3的確定系數(shù)(R2)>0.999(圖2)，計(jì)算所得的校準(zhǔn)品濃度均在指定值的±4%范圍之內(nèi)。 25OHD2的確定系數(shù)(R2)>0.997(圖3) ，計(jì)算所得的校準(zhǔn)品濃度均在指定值的±10%范圍之內(nèi)。

圖2 .血清中25OHD3的校準(zhǔn)曲線。

圖3 .血清中25(OH)D2的校準(zhǔn)曲線。 

準(zhǔn)確度
通過(guò)分析購(gòu)自DEQAS(www.deqas.org)的外部質(zhì)量控制樣品考察分析方法的準(zhǔn)確性。利用Chromsystem單點(diǎn)校準(zhǔn)品繪制出一條過(guò)零點(diǎn)的校準(zhǔn)曲線，用以計(jì)算DEQAS樣品濃度。采用Passing-Bablok線性回歸(Microsoft Office Excel 2003，帶Analyse-It插件1.73版)將Waters 25OHD3的結(jié)果與通過(guò)DEQAS LC/MS方法所得的結(jié)果平均值進(jìn)行對(duì)比。所有結(jié)果均在預(yù)期值的±11.5%偏差范圍之內(nèi)(圖4)。

圖4 .將Waters 25OHD3結(jié)果與DEQAS LC/MS方法所得的結(jié)果平均值進(jìn)行對(duì)比的Passing-Bablok線性回歸分析。

精度
通過(guò)提取低 、中和高濃度的QC樣品并重復(fù)分析5次以測(cè)定批內(nèi)精度。根據(jù)這三個(gè)濃度水平計(jì)算25OHD的變異系數(shù)(CV) 。對(duì)低 、中和高濃度的QC樣品進(jìn)行連續(xù)5天的分析，測(cè)定批間精度。結(jié)果如表2所示。

靈敏度
提取所得的最低濃度內(nèi)部血清校準(zhǔn)品的色譜圖如圖5所示。各色譜圖標(biāo)記了化合物名稱、峰間信噪比(SNR)和濃度。所有響應(yīng)均高于檢測(cè)限(SNR 5:1)，因此，本方法可檢出維生素D嚴(yán)重缺乏癥患者的維生素D水平(<6ng/mL)。

圖5 .色譜圖顯示了最低濃度校準(zhǔn)品和各個(gè)分析物的信噪比測(cè)定結(jié)果。

離子抑制
離子抑制研究表明25OHD3在離子抑制區(qū)域部分洗脫，如圖6所示。

圖6 .25OHD離子抑制分析，通過(guò)放大視圖顯示了25OHD2和25OHD3的洗脫分析結(jié)果。

需使用一種穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物來(lái)補(bǔ)償所觀測(cè)到的各個(gè)分析物之間的基質(zhì)效應(yīng)差異⁵ 。

討論
本文中開發(fā)了一種利用UPLC/MS/MS分析血清中25OHD2和25OHD3的方法。該方法通過(guò)從血清中進(jìn)行液-液萃取以及利用定性和定量離子進(jìn)行各個(gè)分析物定量檢測(cè)。此外，通過(guò)監(jiān)測(cè)定性離子比率提高了準(zhǔn)確識(shí)別分析物的可靠性。測(cè)定結(jié)果表明，本方法具有良好的靈敏度以及批內(nèi)和批間精密度。采用本方法，可以每天分析多達(dá)100個(gè)樣品。 

結(jié)論
本文中開發(fā)的分析血清中25OHD2和25OHD3的方法具有良好的線性、靈敏度和精度。本方法與傳統(tǒng)的免疫測(cè)定法相比，可提供更加可靠的結(jié)果。

UPLC/MS/MS能夠準(zhǔn)確可靠地測(cè)定血清中的250HD2和250HD3，防止誤報(bào)接受D2補(bǔ)充治療的患者體內(nèi)的維生素D總體濃度。 

參考文獻(xiàn)
1.  Gorham ED, Garland CF, Garland FC, Grant WB, Mohr SB, Lipkin M, et al. Optimal vitamin D status for colorectal cancer prevention: a quantitative meta-analysis. Am J Prev Med 2007;32:210–6.
2.  Garland CF, Gorham ED, Mohr SB, Grant WB, Giovannucci EL, Lipkin M, et al. Vitamin D and prevention of breast cancer: pooled analysis. J Steroid Biochem Mol Biol 2007;103:708–11.
3. Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes Institute of Medicine. DRI Dietary Reference Intakes for calcium phosphorus, magnesium, vitamin D and fluoride. National Academy Press,Washington,DC; 1997.
4.  Hollis B. Editorial: The Determination of Circulating 25-Hydroxyvitamin D: No Easy Task. J Clin Endocrinol Metab, July 2004,89(7):3149–3151.
5.  Viswanathan CT. et al. Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays. Pharmaceutical Research 2007;24(10):1962-1973.