Matthew A.Lauber、Stephan M.Koza和Kenneth J.Fountain
沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德市)

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

■兩種具備獨(dú)特選擇性的雜化顆粒色譜柱(BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈)。

■在使用最優(yōu)濃度的HOAc調(diào)節(jié)流動(dòng)相時(shí)，BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈獲得的目標(biāo)肽峰比使用0.1%TFA時(shí)更窄，分離度也更高。利用這一特性，可以通過更少的步驟獲得含有藥用反離子的肽。

■BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈由細(xì)胞色素c的胰蛋白酶消化液進(jìn)行質(zhì)控測(cè)試。

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC® H-ClassBio系統(tǒng)
XSelect™CSH130 C₁₈,5μm
XBridge™BEH130 C₁₈,5μm
MassPREP™肽混合物

關(guān)鍵詞
反相(RP)，肽，乙酸(HOAc)，表面帶電雜化顆粒(CSH)，CSH130 C₁₈，BEH130 C₁₈，制備型色譜，肽分離技術(shù)(PST)

簡(jiǎn)介
經(jīng)證實(shí)，肽在研究中是非常有用的治療劑和標(biāo)記物。通常，為了實(shí)現(xiàn)這些用途，會(huì)通過制備型反相(RP)色譜對(duì)肽進(jìn)行純化。在大多數(shù)情況下，純化出來的肽必須具有高純度。如果存在污染物，會(huì)干擾生物分析的結(jié)果。如果活性藥物成分中存在污染物，后果將會(huì)非常嚴(yán)重。因此，需要較高的色譜分辨率來盡量減少與目標(biāo)肽化學(xué)性質(zhì)非常接近的共洗脫雜質(zhì)。此外，還需要色譜柱填料具有卓越的載樣量，確保實(shí)現(xiàn)最佳的通量和生產(chǎn)率。肽分離使用的流動(dòng)相中通常包含強(qiáng)離子對(duì)試劑，例如三氟乙酸(TFA)。但是，如果選用含有TFA的流動(dòng)相，需要進(jìn)行額外的制備步驟。由于三氟乙酸鹽(TFA鹽)固有的毒性，必須將其除去或置換¹。最好使用毒性較低的反離子，尤如乙酸鹽。實(shí)際上，大部分肽藥都是乙酸鹽或含有乙酸的液體制劑^2-3。因此，盡可能用乙酸(HOAc)流動(dòng)相替代TFA流動(dòng)相，這種做法似乎更有優(yōu)勢(shì)。之前曾有研究表明，在使用HOAc流動(dòng)相和等度反相色譜后，TFA溶液中的肽(例如粗制合成肽)^4-5大部分轉(zhuǎn)化為乙酸鹽形式⁶。同時(shí)，使用高濃度乙酸鹽緩沖液通過簡(jiǎn)單的洗脫步驟進(jìn)行梯度分離，可實(shí)現(xiàn)更徹底的鹽形式轉(zhuǎn)化。⁷總之，使用HOAc流動(dòng)相可簡(jiǎn)化純化過程，有利于通過更少的步驟獲得所需肽和反離子。

本文研究了使用BEH C18和CSH™ C₁₈色譜柱進(jìn)行制備型肽分離的過程。BEH C18是一種有機(jī)硅C₁₈固定相，基于亞乙基橋雜化顆粒(BEH)技術(shù)，并具有卓越的耐用性和pH穩(wěn)定性。表面帶電雜化顆粒(CSH)C₁₈則是BEH C18的升級(jí)產(chǎn)品，其表面被修飾在酸性條件下帶有微弱正電荷。以下數(shù)據(jù)證明了這兩種固定相均適用于高上樣量的肽分離，既可用于TFA調(diào)節(jié)的流動(dòng)相，也可用于HOAc調(diào)節(jié)的流動(dòng)相。并且，在高上樣量下，BEH C18和CSH C₁₈在使用經(jīng)優(yōu)化的HOAc流動(dòng)相時(shí)獲得的目標(biāo)峰均比使用0.1%TFA時(shí)更窄。 

實(shí)驗(yàn)樣品
描述
將MassPREP肽混合物(部件號(hào)186002337，如表1所示)復(fù)溶于0.1%TFA或0.1%HOAc(取決于所用流動(dòng)相)中，使肽的總濃度為0.6或2.0mg/mL(取決于上樣量)。將合成肽的低純度(<70%)制備樣品DFVGYGVKDFVGVGVK復(fù)溶于0.1%TFA/0.1%HOAc中，使?jié)舛葹?或4mg/mL。 

方法條件(除非另有說明)

LC條件
系統(tǒng)：帶20-cm柱溫箱的ACQUITY UPLC H-ClassBio系統(tǒng)
檢測(cè)條件：帶500-nL分析型流通池的ACQUITY UPLC TUV檢測(cè)器
Xevo®G2 vQ-Tof™質(zhì)譜儀
波長：214和250nm
掃描率：2Hz(過濾時(shí)間常數(shù)，1s)
色譜柱：XBridge BEH130 C₁₈4.6×100mm，5μm，多孔，130Å(部件號(hào)186003579)
XSelect CSH130 C184.6×100mm，5μm，多孔，130Å(部件號(hào)186007077)
柱溫：40℃
樣品溫度：10℃
進(jìn)樣體積：50至1000μL，上樣量見下文
流速：1mL/min(在UV檢測(cè)器后分流，以大約20μL/min注入MS源)
流動(dòng)相：參見梯度表
樣品瓶：LCGC認(rèn)證透明玻璃12×32mm螺口Qsert樣品瓶(部件號(hào)186001126C)

A：0.1%(v/v)HOAc水溶液
B：0.1%(v/v)HOAc的90:10ACN/水溶液
或
A：99:1(v/v)水/HOAc–1%HOAc
B：90:9:1(v/v)ACN/水/HOAc–1%HOAc

MS條件
質(zhì)譜儀：Xevo G2Q-Tof
電離模式：ESI+
分析儀模式：分離度
毛細(xì)管電壓：3.00kV
錐孔電壓：25V
源溫度：120°C
脫溶劑氣體溫度：350°C
錐孔氣體流速：0.0L/h
脫溶劑氣體流速：800L/h
校正：NaI，1μg/μL，50至2000m/z
采集：50至1990m/z，
2Hz掃描率

數(shù)據(jù)管理
MassLynx軟件4.1版

結(jié)果與討論
含有九種組分的肽混合物的載量研究
在之前的研究中，已經(jīng)對(duì)CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈在分析型肽分離中的應(yīng)用(例如肽圖繪制)進(jìn)行了廣泛的探討^8-9。簡(jiǎn)而言之，與其他肽分離反相填料相比，CSH130 C₁₈及其創(chuàng)新的表面帶電技術(shù)能夠改善峰形和載量。在分析型應(yīng)用中，尤其是在流動(dòng)相含有極少或不含離子對(duì)試劑時(shí)，可以觀察到峰容量有顯著升高，最高達(dá)到90%。與BEH130 C₁₈相比，CSH130 C₁₈的表面正電荷還提供了獨(dú)特的選擇性和較低的保留性，使得它們成為肽分離色譜填料的絕佳搭配。

為了研究CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈在制備型分離中的表現(xiàn)，采用生產(chǎn)中常用的流動(dòng)相(即含有TFA或HOAc的流動(dòng)相)對(duì)一系列不同肽進(jìn)行了載量研究。這些方法開發(fā)實(shí)驗(yàn)中使用的是5μm顆粒填充的分析柱(4.6mm內(nèi)徑)。

首先在這些色譜柱上進(jìn)行測(cè)試的是MassPREP肽混合物，其包含九種不同的肽，如表1所示。圖1所示為該混合物在半制備型上樣下的一組色譜圖，其中使用了BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈，以及兩種不同的流動(dòng)相，一種含有0.1%TFA，另一種含有0.1%HOAc。使用0.1%TFA時(shí)，BEH色譜柱的平均4峰寬為0.8min。使用0.1%HOAc時(shí)，平均峰寬幾乎翻了一倍，達(dá)到1.5min。HOAc的酸性比TFA弱得多，從而導(dǎo)致流動(dòng)相酸性減弱，離子強(qiáng)度和離子配對(duì)能力均顯著降低。因此預(yù)計(jì)使用HOAc代替TFA時(shí)，大部分C₁₈柱的峰形會(huì)較差。這一假設(shè)對(duì)于BEH130 C₁₈的半制備型上樣是成立的，如圖1所示。然而對(duì)于CSH130 C₁₈色譜柱，用HOAc替換TFA時(shí)峰形仍保持良好。使用0.1%TFA流動(dòng)相和0.1%HOAc流動(dòng)相時(shí)，在CSH130色譜柱中觀察到的平均4峰寬分別為0.5和0.6min。峰寬數(shù)據(jù)匯總于圖2中，其中分別繪出了在不同色譜柱類型和流動(dòng)相條件下混合物中每種肽的峰寬。除了半制備型上樣量的數(shù)據(jù)之外，圖中還顯示了分析型上樣量的數(shù)據(jù)。此圖表明BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈在一些條件下會(huì)生成類似的肽峰形，包括0.1%TFA的分析型上樣量。但是，在其他條件下，例如0.1%HOAc的半制備型上樣量，CSH130 C₁₈生成的峰要窄得多。正如之前研究所證實(shí)^8-9，CSH130 C₁₈在使用含有極少或不含離子對(duì)試劑的酸性流動(dòng)相時(shí)，獲得的肽峰形明顯更好。同時(shí)也表明，當(dāng)上樣量高于常規(guī)分析20倍時(shí)，這種現(xiàn)象更為明顯。

低純度合成肽
制備型分離往往要求上樣量必須達(dá)到(有時(shí)要高于)分析型分離所用上樣量的1000倍。使用序列為DFVGYGVKDFVGVGVK的低純度合成肽(一種中性肽，pI=6，1.7kDa)，對(duì)低于此范圍和此范圍之內(nèi)的上樣量進(jìn)行研究。在BEH和CSH色譜柱上采用聚焦梯度分離以縮短運(yùn)行時(shí)間，使用低靈敏度波長(250nm)檢測(cè)以獲取完整峰形。

首先使用經(jīng)0.1%HOAc調(diào)節(jié)的流動(dòng)相對(duì)半制備型和制備型上樣量進(jìn)行分析，如圖3所示。BEH色譜柱上的半制備型上樣量(50μg)產(chǎn)生的目標(biāo)肽峰帶有明顯拖尾，這與常見的Langmuirian等溫線一致。相反，在制備型上樣量(1mg)下，目標(biāo)肽的洗脫峰呈略微前伸，正如典型的anti-Langmuirian等溫線。我們知道，當(dāng)肽以兩性離子形式存在時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)anti-Langmuirian等溫線¹⁰。由此可知，經(jīng)0.1%HOAc調(diào)節(jié)的流動(dòng)相酸性不足以將這種合成肽的羧基完全質(zhì)子化，肽可能同時(shí)以陽離子和兩性離子存在。兩性離子的相對(duì)含量應(yīng)隨上樣量增大而增大，尤其是在目標(biāo)肽濃度超過流動(dòng)相的質(zhì)子化/緩沖能力情況下。這就解釋了BEH色譜柱上樣量增大時(shí)峰形出現(xiàn)的巨大變化。

有趣的是，正如在圖3中所看到的，對(duì)于BEH130 C₁₈，在制備型上樣量下使用0.1%HOAc似乎更容易獲得較窄的目標(biāo)肽峰。在這些條件下，BEH色譜柱得到的目標(biāo)肽峰比CSH色譜柱更窄。事實(shí)上，CSH130 C₁₈使用0.1%HOAc時(shí)在兩種上樣量下都獲得了前伸峰。由于其表面所帶的正電荷最大程度地減少了肽的拖尾，所以出現(xiàn)這種情況是意料之中的^8-9。因此，前伸峰形也更加明顯。由于沒有拖尾峰，制備型上樣量下CSH柱的目標(biāo)峰寬度實(shí)際上要大于BEH柱。

基于此，CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈生成最佳峰形的流動(dòng)相條件應(yīng)該有所不同。為此，還使用10倍酸性的酸(1%HOAc)調(diào)節(jié)的流動(dòng)相進(jìn)行了分離。盡管中等濃度對(duì)于開發(fā)純化工藝可能具有一定參考價(jià)值，但此處未對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。如圖3所示，改變流動(dòng)相組分后，CSH柱的峰形大大改善，但BEH柱的峰形變得更差。使用二者各自的最佳HOAc流動(dòng)相時(shí)，BEH柱(0.1%HOAc)和CSH柱(1%HOAc)都能生成較窄的目標(biāo)肽峰(半峰寬分別為0.5和0.6min)。為了參照，使用0.1%TFA作為離子對(duì)試劑進(jìn)行了分離，如圖3中右側(cè)所示。在使用TFA時(shí)，CSH130 C₁₈上的目標(biāo)肽峰寬為0.6min，BEH130 C₁₈上則為1.1min。無論選用哪種色譜柱填料，使用優(yōu)化的HOAc流動(dòng)相獲得的肽目標(biāo)峰都遠(yuǎn)遠(yuǎn)窄于TFA流動(dòng)相。這些結(jié)果表明，乙酸流動(dòng)相對(duì)于肽制備型分離更為實(shí)用。

較窄的目標(biāo)肽峰往往伴隨著更高的雜質(zhì)分離度，從而有機(jī)會(huì)收集到純度更高的流分。色譜柱填料和流動(dòng)相添加劑對(duì)DFVGYGVKDFVGVGVK制備型上樣量的影響如圖4所示，其中重點(diǎn)顯示了基線以及每種分離方法對(duì)目標(biāo)峰中雜質(zhì)的分離能力，這些雜質(zhì)已通過MS確認(rèn)。如前所述，HOAc流動(dòng)相獲得的目標(biāo)峰更窄。圖4還表明，使用HOAc流動(dòng)相也在最大程度上減少了所監(jiān)測(cè)雜質(zhì)的共洗脫。此外，很明顯可以看出，通過使用不同的流動(dòng)相添加劑和兩種不同的色譜柱填料，目標(biāo)肽和雜質(zhì)之間的色譜選擇性發(fā)生了極大的變化。就此項(xiàng)載量研究篩選的參數(shù)而言，采用1%HOAc流動(dòng)相的CSH柱提供的目標(biāo)肽峰最窄，并且所監(jiān)測(cè)雜質(zhì)的共洗脫也最少。不過，使用BEH色譜柱和0.1%HOAc流動(dòng)相也能獲得與此相當(dāng)?shù)姆蛛x效果。具有不同選擇性和最佳添加劑濃度的色譜柱填料將會(huì)有利于高難度制備型分離工藝的開發(fā)。

以上我們僅對(duì)合成肽的中等制備型上樣量(1mg)結(jié)果進(jìn)行了討論。圖5所示為4mg肽上樣得到的色譜圖。這一上樣量對(duì)應(yīng)0.5g原料，對(duì)于較大的50mm內(nèi)徑色譜柱，這是非常高的單次進(jìn)樣生產(chǎn)率。從這些數(shù)據(jù)可以明顯看出，CSH和BEH色譜柱都適合用于高上樣量。值得注意的是，從半制備型(50μg)到制備型(4mg)，CSH色譜柱獲得的峰形保持了驚人的一致。當(dāng)需要在不消耗大量樣品前提下開發(fā)分離方法時(shí)，這種高度可預(yù)測(cè)性可能會(huì)非常有用。

結(jié)論
根據(jù)對(duì)分析型內(nèi)徑色譜柱進(jìn)行的載量研究，5-μm BEH130 C₁₈和5-μm CSH130 C₁₈在使用含TFA或HOAc的流動(dòng)相時(shí)均顯示出有利于制備型肽分離的巨大潛力。BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈色譜柱都具備有益特性。在酸性條件下，CSH130 C₁₈與BEH130 C₁₈相比顯示出更高的載樣能力，并且通常能產(chǎn)生更窄的目標(biāo)峰。因此，CSH130 C₁₈流分體積更少，這一特性對(duì)后續(xù)的純化和去溶劑步驟可能會(huì)有幫助。BEH130 C₁₈則極適于中性/堿性pH環(huán)境下的制備分離，因其在此類條件下具有更長更高的溫度穩(wěn)定性。最后，CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈還各自表現(xiàn)出獨(dú)特選擇性，成為解決高難度雜質(zhì)/目標(biāo)肽分析問題的有效搭配。

比上述特性更引人注意的是，兩種固定相分別在不同濃度的流動(dòng)相添加劑下對(duì)制備級(jí)上樣量的合成肽取得了最佳效果。使用優(yōu)化的HOAc時(shí)取得的峰形最佳，比使用0.1%TFA效果更好。這意味著可以利用這些雜化顆粒C₁₈色譜柱簡(jiǎn)化純化工藝，因?yàn)槭褂肏OAc流動(dòng)相可用更少的步驟即獲得含有藥用反離子的肽。

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