新物體識(shí)別、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠認(rèn)知行為的影響機(jī)制

Ø 摘要

目的 研究年齡、性別對(duì)小鼠新物體再認(rèn)（novel-object recognition）能力和曠場(chǎng)活動(dòng)的影響，了解兩類行為間的關(guān)系。

Ø 方法 

實(shí)驗(yàn)于2004-05在安徽省老年病研究所行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。入組的47只昆明小鼠被分成兩組：青年組（七八月齡，12雄、11 雌）和老年組（17、8月齡，12雄、12雌）。采用新物體再認(rèn)任務(wù)檢測(cè)小鼠的非空間短期記憶能力，采用曠場(chǎng)任務(wù)檢測(cè)小鼠的探索活性（locomotor）行為，并用主因子分析判斷任務(wù)間的關(guān)系。結(jié)果[ 在新物體再認(rèn)記憶任務(wù)中，老年雌鼠的新物體優(yōu)先指數(shù)為（55.6±4.9）%，顯著低于年輕雌鼠（66.6±3.7）%。在曠場(chǎng)任務(wù)中，老年雌鼠的探索運(yùn)動(dòng)活性減低，并且雌雄老年鼠在曠場(chǎng)周邊所花的時(shí)間［（294.4±2.0），（289.3±4.3）s］比各自對(duì)應(yīng)的青年小鼠［（278.2±4.9），（267.2±6.3）s］均多。新物體再認(rèn)成績(jī)與曠場(chǎng)任務(wù)中的周邊時(shí)間呈正相關(guān)，而與跨格數(shù)負(fù)相關(guān)。

結(jié)論 雌性老年昆明小鼠有新物體再認(rèn)（短期記憶）能力損害，且受曠場(chǎng)行為影響。

主題詞：衰老；小鼠；學(xué)習(xí)；記憶；行為

Ø 引言

小鼠年齡相關(guān)性記憶減退，尤其是空間性記憶減退，已得到了深入研究，且海馬與空間學(xué)習(xí)記憶有關(guān)已得到了充分證明［1-8］。然而，衰老對(duì)非空間性學(xué)習(xí)記憶能力的影響主要集中在電休克逃避任務(wù)上。新物體再認(rèn)記憶是海馬依賴性任務(wù)，但衰老是否影響該記憶尚無(wú)研究證明。昆明小鼠是中國(guó)實(shí)驗(yàn)室最常使用的小鼠，但對(duì)其衰老相關(guān)的行為改變很少進(jìn)行探索。在目前的研究中，作者利用新物體再認(rèn)程序觀察昆明小鼠是否有年齡或性別相關(guān)性新物體再認(rèn)（novel-object recognition，一種非空間性學(xué)習(xí)記憶）能力減退。若有，是否受類似實(shí)驗(yàn)環(huán)境的曠場(chǎng)（open-field）探索行為（locomotor）的影響。

Ø 材料和方法

設(shè)計(jì)：以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為研究對(duì)象，應(yīng)用兩因素方差分析的隨機(jī)對(duì)照、盲法試驗(yàn)。

單位：一所大學(xué)醫(yī)院的神經(jīng)內(nèi)科和老年病研究所、一所大學(xué)的生命科學(xué)院。

材料：實(shí)驗(yàn)于2004-05在安徽省老年病研究所行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自安徽省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（皖醫(yī)動(dòng)92002號(hào)）�？偣�47只昆明小鼠按年齡分成兩組，23只七八月齡的青年鼠（12雄、11雌）和24只17、8八月齡的老年鼠（雌雄各12只）。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)選，有運(yùn)動(dòng)障礙、脫毛、體表可見(jiàn)明顯腫塊及大肚的小鼠被排除。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始5 周前，將小鼠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室里塑料鼠籠中（大小為25.5cm×15.0cm×14.0cm），籠內(nèi)放鋸木屑。其中雌鼠群養(yǎng)（每籠四五只）、雄，單養(yǎng)。每天至少接觸小鼠1次（拎其尾、撫摸）。除非特別提及，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由進(jìn)食和進(jìn)水。喂養(yǎng)環(huán)境的明暗周期為12h（7:00開(kāi)燈，19:00關(guān)燈），室溫為（21±1）℃，濕度為（55±5）% 。實(shí)驗(yàn)者不知小鼠的分組。實(shí)驗(yàn)在亮周期內(nèi)完成。每次實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1h，小鼠自飼養(yǎng)室移至檢測(cè)室以保持小鼠對(duì)環(huán)境的適應(yīng)。

設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者：為本文所有作者。實(shí)驗(yàn)采用3盲方法進(jìn)行，即小鼠的分組者、實(shí)驗(yàn)及評(píng)估者和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)者的工作由3人獨(dú)立完成，評(píng)估者為經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)員。

方法：儀器和行為學(xué)程序按照以前出版的方法加以部分修改，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)曠場(chǎng)行為程序來(lái)測(cè)定小鼠的自發(fā)性探索運(yùn)動(dòng)活性和焦慮性，一個(gè)新物體再認(rèn)行為程序來(lái)測(cè)定小鼠的非空間性短期記憶。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：儀器由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，www.softmaze.com。為一開(kāi)口的黑色木盒（內(nèi)部大小為81cm×81cm），圍墻高28cm。盒底漆成縱橫各3條白線（寬3mm），從而形成16個(gè)等大的方格（每格大小20cm×20cm）。場(chǎng)地的中央置一彩色盒子（8cm×5cm×3cm）以激發(fā)小鼠的好奇心。照明來(lái)自一高出場(chǎng)地中央2.8m的40w白熾燈。每只小鼠接受1次測(cè)試，其間小鼠面朝墻放入4個(gè)拐角方格之一，并讓其自由探索環(huán)境5min。每只小鼠的測(cè)試結(jié)束后，清水清洗場(chǎng)地并擦干。

新物體識(shí)別：裝置由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，www.softmaze.com，是一個(gè)漆成黑色的開(kāi)口木方盒子（50cm×50cm×25cm）。一白熾燈提供盒底水平約150lx的照明。在測(cè)試期間，小鼠現(xiàn)放入空盒內(nèi)并允許自由探索5min以期適應(yīng)環(huán)境。然后，將小鼠移入飼養(yǎng)籠內(nèi)。5min后，小鼠返回盒內(nèi)進(jìn)入受訓(xùn)期。此時(shí)，有兩個(gè)完全相同的物體（彩色紙盒，大小為6.0cm×6.0cm×3.5cm）于距盒壁8cm處沿一方墻直線排開(kāi)。小鼠自另外兩個(gè)拐角之一放入盒內(nèi)，在自由探索5min后再被送回飼養(yǎng)籠內(nèi)。待5min間歇后，動(dòng)物被再引入實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)期的自由探索。此時(shí)，兩個(gè)受訓(xùn)期使用過(guò)的彩色紙盒之一被一紫色小盒（7.0cm×7.0cm×5.5cm）置換并位于原位，而另一已熟悉過(guò)的彩色紙盒被移至新物體相對(duì)的拐角以防止小鼠空間的偏倚。如果小鼠用它的鼻子在1cm之內(nèi)指向物體或觸及鼻子則被視為探索行為。

主要觀察指標(biāo)：曠場(chǎng)任務(wù)是記錄實(shí)驗(yàn)期內(nèi)小鼠跨越的方格總數(shù)和周邊時(shí)間(花在周邊12個(gè)方格的總時(shí)間）。在新物體再認(rèn)任務(wù)中分別記錄實(shí)驗(yàn)期探索熟悉物體（TF）和探索新物體（TN）的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)期對(duì)新物體的優(yōu)先指數(shù)（PLN）被定義成TN/(TF+TN)*100%。同樣，在受訓(xùn)期也分別記錄探索物體1(T01）和物體2（T02)）的總時(shí)間，以及對(duì)物體1（PI01）和物體2（PI02）的優(yōu)先指數(shù)。受訓(xùn)期（TTTR）和實(shí)驗(yàn)期（TTTE）的總探索時(shí)間也進(jìn)入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

Ø 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法是兩因素方差分析，年齡和性別是獨(dú)立變量。為避免不同性別在兩因素方差分析統(tǒng)計(jì)時(shí)年齡相關(guān)性成績(jī)下降的模式不同而造成的混淆，用“單性別< 的方差分析（即每個(gè)性別的單因素方差分析來(lái)顯示年齡主效應(yīng)［2］。類似地，“單年齡”的方差分析，即每個(gè)年齡的單因素方差分析）用于顯示性別主效應(yīng)。

為了探索任務(wù)內(nèi)和任務(wù)間的相互關(guān)系，作者利用了主因子分析技術(shù)［2，11］與以前的研究類似［2，11］，初始因子的模式經(jīng)Varimax法轉(zhuǎn)換，Eigen值大于1的因子得以保留。P＜0.05時(shí)被視為有顯著性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由SPSS for window11.5軟件經(jīng)第一作者完成。

Ø 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析由于周期短，實(shí)驗(yàn)幾乎不對(duì)動(dòng)物造成應(yīng)激、饑餓方面的影響及體力消耗，全部47只小鼠無(wú)中途脫失及死亡，所有動(dòng)物的數(shù)據(jù)都進(jìn)入了結(jié)果分析。

2.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果  老年雌鼠和雄鼠的平均周邊時(shí)間比各自的青年鼠顯著性延長(zhǎng)［F(1,21)=9.96,P＜0.01;F(1,21)=8.42,P＜0.01］。這些不同主要是年齡效應(yīng)所致［F(1,45)=17.44,P＜0.01］，而性別的影響較�。跢(1,45)=2.99,P=0.091］。年齡和性別的相互作用極小［F(1,45)＜1］。

年齡和性別都不影響小鼠的跨格數(shù)［F(1,45)=2021,1.09;Ps＞0.05］，年齡和性別的相互作用對(duì)跨格數(shù)也無(wú)效應(yīng)［F(1,45)＜1］。然而，“單性別”方差分析表明老年雌鼠的探索運(yùn)動(dòng)活性（locomotor activity）顯著低于青年雌鼠［F(1,21)=4.87,P＜0.05］，但是，“單年齡”方差分析顯示老年雌雄小鼠間的跨格數(shù)差異無(wú)顯著性意義［F(1,21)=2.08,P＞0.05］。

2.3新物體再認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果  兩因素方差分析表明TTTR和TTTE不受年齡［F(1,45)=2.21,1.09;Ps＞0.05］和性別［F(1,45)=0.24,2.78;Ps＞0.05］的影響，但受年齡性別相互作用的強(qiáng)力影響［F(1,43)=18.39,8.02;Ps＜0.001，0.01］。進(jìn)一步的“單性別”方差分析和“單年齡”方差分析顯示老年雌鼠的TTTR和TTTE顯著短于青年雌鼠［F(1,21)=14.08,9.34;P=0.001，＜0.01］和老年雄鼠［F(1,22)=14.03,6.84;P=0.001，＜0.05］，但青年雌鼠比同齡雄鼠有較長(zhǎng)的TTTR［F(1,21)=6.08,9.34;P＜0.05］和類似的TTTE［F(1,21)=1.31,6.84;P＞0.05］。然而，年齡、性別和年齡與性別的相互作用并不顯著影響PI01和PI02［F(1,45/43)＜1］。

對(duì)于優(yōu)先指數(shù)，當(dāng)所有動(dòng)物一起分析時(shí)，重復(fù)測(cè)定方差分析表明PIn 顯著高于PI01或PI02［F(1,46)=18.77,14.81;Ps＜0.001］。提示在敞口場(chǎng)地內(nèi)，昆明小鼠有記住熟悉物體并習(xí)慣于優(yōu)先探索新物體的能力。影響該效應(yīng)的年齡［F(1,45)=3.97, P=0.052］而不是性別［F(1,45)＜1］和年齡與性別的相互作用［F(1,43)＜1］。兩因素方差分析表明年齡［F(1,45)=6.41, P＜0.05］顯著影響PIn，而性別［F(1,45)＜1］和性別與年齡的相互作用并無(wú)影響［F(1,43)＜1］�！皢涡詣e”方差分析顯示老年雌鼠比青年雌鼠的PIn顯著要�。跢(1,21)=4.47,P＜0.05］。

2.4主因子分析樣本適合度的KMO值（Kaiser-Meyer-Olkin measure of sampling adequacy）為0.665（＞0.05），并且在Bartlett球形假設(shè)中P＜0.001，說(shuō)明本研究中所選擇的指標(biāo)適合進(jìn)行主因子分析。結(jié)果獲得了3個(gè)有顯著意義的因子。旋轉(zhuǎn)于各因子上的不同變量的成分負(fù)荷。在任務(wù)內(nèi)，新物體再認(rèn)任務(wù)的5個(gè)指標(biāo)分屬于3個(gè)不同的因子，即訓(xùn)練期和實(shí)驗(yàn)期的探索總時(shí)間旋轉(zhuǎn)于因子2，訓(xùn)練期對(duì)物體1和物體2的優(yōu)先指數(shù)旋轉(zhuǎn)于因子1但方向相反，而實(shí)驗(yàn)期對(duì)新物體的優(yōu)先指數(shù)旋轉(zhuǎn)與因子3；曠場(chǎng)任務(wù)的2個(gè)指標(biāo)均旋轉(zhuǎn)于因子3，方向也相反。在任務(wù)間，新物體優(yōu)先指數(shù)和周邊時(shí)間同旋轉(zhuǎn)于因子3而方向相反，和跨格數(shù)也同旋轉(zhuǎn)于因子3而方向相同。

Ø 討論

3.1 老年小鼠的移動(dòng)探索活性曠場(chǎng)任務(wù)是頻繁應(yīng)用于衰老小鼠行為學(xué)研究的任務(wù)之一［1,2,12］。本文的結(jié)果顯示由跨格數(shù)代表的移動(dòng)探索活性在老年雌鼠比青年雌鼠低。使用曠場(chǎng)或光束活性系統(tǒng)，以前的研究報(bào)告了其他許多株的衰老小鼠的移動(dòng)探索活性降低［2,4,12］。代表移動(dòng)探索活性的探索行為主要是沿場(chǎng)地的側(cè)墻進(jìn)行的，盡管有一個(gè)新奇物體（一個(gè)用于激發(fā)小鼠好奇心的彩色紙盒）位于場(chǎng)地中央。兩性老年昆明小鼠的周邊時(shí)間明顯長(zhǎng)于各自的青年鼠，提示老年昆明小鼠的焦慮性高于青年小鼠。這與老年大鼠和中至老年雌雄NMRI小鼠在高架十字迷宮中的觀察一致。作者認(rèn)為，老年昆明小鼠移動(dòng)探索活性的降低很可能是焦慮性增加所致，而不是像其他研究者在對(duì)老年OF1和NMRI雌鼠進(jìn)行研究時(shí)特別提到的那樣是由于探索活動(dòng)減少、好奇心降低和體能下降所致，因?yàn)楸M管雌雄老年昆明小鼠的焦慮性均增加，只有老年雌鼠的移動(dòng)探索活性降低。本文的老年昆明小鼠在曠場(chǎng)中表現(xiàn)出類似焦慮性的結(jié)果與老年C57BL/6NIA小鼠在高架十字迷宮中表現(xiàn)出的結(jié)果稍有不同，即17 月齡C57BL/6NIA雌鼠（該株的中年小鼠）比同齡雄鼠和青年（5月齡）雌鼠更焦慮。然而，老年鼠（25月齡）的焦慮性與青年鼠相似。由于小鼠的曠場(chǎng)行為與小鼠的食物儲(chǔ)藏行為有一定的類似性，所以，昆明小鼠的曠場(chǎng)行為年齡相關(guān)性改變可能受其年齡相關(guān)性食物儲(chǔ)藏行為改變的影響。

3.2老年昆明小鼠非空間認(rèn)知能力的改變?cè)诒狙芯恐校�作者用了新物體再認(rèn)任務(wù)來(lái)測(cè)定昆明小鼠非空間學(xué)習(xí)記憶能力是否隨衰老而改變。該任務(wù)是海馬依賴性任務(wù)之一，并且很少用于衰老小鼠認(rèn)知能力的評(píng)價(jià)。老年雌鼠比青年雌鼠的PIN小，提示老年雌雄昆明小鼠的非空間短期記憶的某個(gè)方面有損害。最近，不同探索時(shí)間對(duì)PIn的效應(yīng)已得到研究。為了獲得PIn，已有人推薦總探索時(shí)間要累計(jì)到相同水平。在老年雌鼠，盡管過(guò)短的探索時(shí)間對(duì)老年雌鼠認(rèn)知功能損害產(chǎn)生了效應(yīng)的可能性不能完全排除，老年雌鼠在新物體再認(rèn)任務(wù)中的較差表現(xiàn)很可能還是源自自身的認(rèn)知功能損害。其理由是：盡管老年雌鼠在受訓(xùn)期和實(shí)驗(yàn)期的探索總時(shí)間確實(shí)要短于青年雌鼠，但兩組小鼠在受訓(xùn)期在物體1和物體2上各花了50%的時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)期，盡管青年雌鼠在新物體上花去了67%的時(shí)間（Pin=0.667），但老年雌鼠花在新物體上的時(shí)間僅56%（Pin=0.556）。這提示老年雌鼠可能由于認(rèn)知能力損害而不能區(qū)別熟悉物體和新物體，從而導(dǎo)致花在新物體上的時(shí)間過(guò)少。

3.3 認(rèn)知任務(wù)中性別的差異在各種不同的種屬，空間學(xué)習(xí)記憶能力的性別差異已充分證明。在八臂輻射狀迷宮任務(wù)中，青年雌鼠的成績(jī)比雄鼠好。對(duì)于正常衰老的小鼠，很少有資料直接顯示認(rèn)知能力下降的性別差異。Frick等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)17月齡雌性C57BL/6NIA小鼠在Morris中表現(xiàn)出更多的空間參考記憶損害，但25月齡小鼠并無(wú)性別差異。本文結(jié)果提示某些非空間認(rèn)知能力，如新物體再認(rèn)能力的年齡相關(guān)性下降，在雌性要比雄性出現(xiàn)早。值得提及的是像以上討論的那樣，本實(shí)驗(yàn)中所顯示的性別和年齡相關(guān)性非空間的學(xué)習(xí)記憶損害也許是雌（群養(yǎng)）雄（單養(yǎng)）小鼠之間不同的飼養(yǎng)環(huán)境所致。然而，飼養(yǎng)效應(yīng)可能不是主要的混雜因素。其理由是：1年齡相關(guān)性學(xué)習(xí)記憶能力的損害僅發(fā)生在群養(yǎng)的老年雌鼠而不是單養(yǎng)的老年雄鼠身上。2在新物體再認(rèn)任務(wù)中，老年雄鼠的成績(jī)優(yōu)于老年雌鼠。3單養(yǎng)的青年雄鼠的成績(jī)好于群養(yǎng)青年雌鼠。當(dāng)然，最后的結(jié)論尚需單養(yǎng)或群養(yǎng)雌雄鼠才能獲得。

3.4 任務(wù)內(nèi)和任務(wù)間指標(biāo)的相互關(guān)系主因子分析已用于研究老年和青年小鼠以區(qū)別屬于不同學(xué)習(xí)記憶任務(wù)指標(biāo)的性質(zhì)，但它并未用以區(qū)別學(xué)習(xí)記憶任務(wù)和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)任務(wù)指標(biāo)的性質(zhì)。本文的結(jié)果顯示新物體再認(rèn)任務(wù)內(nèi)的指標(biāo)測(cè)定的可能是認(rèn)知功能的不同方面，曠場(chǎng)任務(wù)則測(cè)定的是感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能方向相反的方面。一些以前的研究試圖確定不同行為任務(wù)組內(nèi)任務(wù)間的相互關(guān)系，但所獲的結(jié)論是相互抵觸的。在一個(gè)任務(wù)組內(nèi)，僅發(fā)現(xiàn)17~22 月齡NMRI小鼠較高的曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)活性與其在Morris水迷宮內(nèi)的成績(jī)負(fù)相關(guān)。在另一研究中，又發(fā)現(xiàn)了許多任務(wù)間的相互關(guān)系。在本文的任務(wù)組內(nèi)，曠場(chǎng)測(cè)定的是移動(dòng)探索活動(dòng)成分。顯然，新物體再認(rèn)任務(wù)也由明顯的移動(dòng)探索成分。

結(jié)論：本文的結(jié)果顯示，新物體再認(rèn)的與曠場(chǎng)跨格數(shù)正相關(guān)，而與周邊時(shí)間負(fù)相關(guān)。這提示昆明小鼠的移動(dòng)探索活性越強(qiáng)，新物體再認(rèn)能力也越強(qiáng)。與此相反，昆明小鼠的焦慮性越大，其新物體再認(rèn)能力也越差。