摘 要：目的: 探討柴胡注射液對學(xué)習(xí)記憶行為影響的機(jī)制。方法: 每天2 次給予小鼠腹腔注射不同劑量的柴胡注射液, 連續(xù)5 天后采用行為觀察和生化檢測相結(jié)合的方法, 研究柴胡注射液對小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響, 包括劑量- 效應(yīng)關(guān)系和時間- 效應(yīng)關(guān)系以及腦內(nèi)超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 和NO 含量的變化。結(jié)果: 與注射生理鹽水的對照組相比, 在5 種劑量( 50 、100 、200 、400 和800 mg / kg) 中除了50 mg / kg 外, 其他4 種劑量的柴胡注射液均能顯著提高小鼠Y- 迷宮分辨學(xué)習(xí)的能力及24 h 記憶保持率, 其中400 mg / kg 劑量的效果最好; 最佳劑量的柴胡注射液易化記憶的作用在訓(xùn)練后24 ~ 72 h 均顯著增強(qiáng)( P < 0.01 ) , 以24 h 最為顯著; 最佳劑量的柴胡注射液可顯著提高行為訓(xùn)練后小鼠腦內(nèi)SOD 的活性( P < 0.01 ) 、降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 水平( P < 0.01 ) 以及提高NO 含量( P < 0.01 ) 。結(jié)論: 適當(dāng)劑量的柴胡注射液在一定時間內(nèi)具有提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的功效, 該作用可能與伴隨的腦組織抗氧化能力提高和NO 含量改變有關(guān)。

 

關(guān)鍵詞：柴胡; 學(xué)習(xí)記憶; 超氧化物歧化酶; 丙二醛; 一氧化氮

 

學(xué)習(xí)和記憶是神經(jīng)科學(xué)研究中的一個重要領(lǐng)域, 越來越多證據(jù)表明機(jī)體內(nèi)過量自由基的產(chǎn)生與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān).近年來研究發(fā)現(xiàn), 柴胡對缺血再灌注引起的肝腎損傷具有保護(hù)作用, 其機(jī)制可能與抑制氧自由基形成有關(guān), 但關(guān)于其對學(xué)習(xí)記憶的影響尚未有報道。因此, 本研究通過對柴胡小鼠學(xué)習(xí)記憶行為和腦內(nèi)生化指標(biāo)的觀測, 初步探討柴胡改善學(xué)習(xí)記憶的作用及機(jī)制。

 

 

1.1    材料

 

昆明種小鼠, 雄雌各半, 體重18 ~ 22 g, 由東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動物實驗中心提供, 適應(yīng)性飼養(yǎng)2 天后正式進(jìn)入實驗。柴胡注射液( 每1 ml 含柴胡生藥1 g) 為陜西西安亞寶制藥廠生產(chǎn), 批號20030404 ; 腦內(nèi)超氧化物歧化酶( SOD) 測定試劑盒( 批號20031003 ) 、丙二醛( MDA) 測定試劑盒( 批號20031003) 、NO 測定試劑盒( 批號20031003) 及考馬斯亮蘭蛋白測定盒( 批號20031003 ) 均由南京建成生物工程公司提供。其他試劑均為分析純。

 

1.2 方法

 

1.2.1 分組及給藥方法

 

將140 只小鼠隨機(jī)分成空白對照組、生理鹽水對照組、50 mg / kg 柴胡組、100 mg / kg 柴胡組、200 mg / kg 柴胡組、400 mg / kg 柴胡組和800 mg / kg柴胡組。各組小鼠按各自所配濃度0.2 ml / 10g 腹腔注射, 每天2 次, 間隔8 h , 連續(xù)給藥5 天, 生理鹽水對照組腹腔注射等體積生理鹽水。1.2.2 Y- 迷宮分辨學(xué)習(xí)的檢測方法小鼠分辨學(xué)習(xí)能力的檢測按文獻(xiàn)[ 5 ] 方法進(jìn)行。1 天內(nèi)連續(xù)分段訓(xùn)練小鼠, 每10 次為一段, 兩段間小鼠休息1 min , 一直訓(xùn)練到10 次反應(yīng)中有9 次正確反應(yīng)( 即90% 的正確反應(yīng)率) 作為學(xué)會的標(biāo)準(zhǔn)。記錄小鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練的次數(shù), 次數(shù)越少, 說明學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。將給予柴胡處理的小鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練的次數(shù)與正常小鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練的次數(shù)相比, 計算學(xué)習(xí)改善率, 反映小鼠學(xué)習(xí)能力改變的情況。間隔24 h 檢測小鼠在10 次訓(xùn)練中的正確次數(shù), 代表小鼠的24 h 記憶成績。將小鼠的24 h 記憶成績與學(xué)會的標(biāo)準(zhǔn)相比, 計算24 h 記憶保持率。同法檢測小鼠的48 和72 h 記憶保持率。保持率越高, 說明動物的記憶力越好。1.2.3 小鼠腦組織SOD 活性、MDA 含量及NO 含量的測定SOD 活性測定 小鼠行為檢測后, 立即斷頭處死, 冰上取大腦, 用生理鹽水制備10% 腦組織勻漿液, 4℃離心取上清液, 用721 型分光光度計在波長550 nm 處測定其光密度值, 并按公式算出SOD 的活性。MDA 含量的測定 小鼠行為檢測后, 立即斷頭處死, 冰上取大腦, 用生理鹽水制備2 % 腦組織勻漿液, 4 ℃離心取上清液, 用721 型分光光度計在532 nm 波長處測定其光密度值, 再按公式求出MDA 生成量。NO 含量的測定 實驗結(jié)束后小鼠立即斷頭處死, 冰上分離大腦, 去除嗅球和小腦, 用冰生理鹽水沖洗血跡, 再用濾紙擦干, 電子分析天平稱重, 按腦組織: 生理鹽水為0.5 g ∶1 ml 比勻漿, 以3 000 r / min,4℃離心15 min , 取上清液, 凍存待測。由專業(yè)技師嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行操作。

 

1.2    統(tǒng)計學(xué)方法

 

用Grubb 法對實驗數(shù)據(jù)的可疑值進(jìn)行取舍, 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x ±s ) 表示, 組間比較采用t 檢驗。P < 0.05 為差異有顯著性。

 

 

2.1 柴胡注射液對小鼠學(xué)習(xí)記憶影響的劑量- 效應(yīng)關(guān)系Y- 迷宮行為檢測結(jié)果顯示, 不同劑量的柴胡注射液對小鼠分辨學(xué)習(xí)能力和記憶保持的影響并不一致。如表1 所示, 與生理鹽水對照組相比, 除50 mg / kg 劑量的柴胡注射液組對小鼠的分辨學(xué)習(xí)能力的影響無統(tǒng)計學(xué)意義外, 其他4 種劑量的柴胡注射液均顯著增強(qiáng)小鼠的分辨學(xué)習(xí)能力( P < 0.01 ) ,呈明顯的劑量- 效應(yīng)關(guān)系; 對記憶保持百分率而言,除50 mg / kg 劑量以外, 其他4 種劑的柴胡注射液都有明顯易化記憶的作用。與生理鹽水對照組相比,100 ~ 800 mg / kg 的劑量都顯著提高24 h 的記憶持率, 其中400 mg / kg 的效果最好, 其記憶保持率提高34.45% 。

 

2.2 柴胡注射液對小鼠記憶影響的時間- 效應(yīng)關(guān)系由上述量- 效關(guān)系說明400 mg / kg 的柴胡注射液對小鼠24 h 記憶保持的易化作用最佳。本實驗進(jìn)一步用該劑量觀察了柴胡注射液對小鼠Y- 迷宮分辨學(xué)習(xí)的48 及72 h 記憶保持的影響。結(jié)果表明400mg / kg 的柴胡注射液易化記憶的作用在訓(xùn)練后24 ~72 h 均顯著增強(qiáng)( P < 0.01 ) , 以24 h 最為顯著, 雖然48 ~ 72 h 有所下降, 但仍明顯地優(yōu)于該時相的生理。

 

2.3 柴胡注射液對小鼠腦組織SOD 活性和MDA生成的影響為探討柴胡注射液提高小鼠分辨學(xué)習(xí)能力, 增強(qiáng)記憶的腦內(nèi)機(jī)制, 空白對照組、生理鹽水對照組和最佳劑量( 400 mg / kg) 柴胡注射液組的小鼠行為檢測后進(jìn)行腦組織SOD 活性和MDA 含量的測定。該劑量的柴胡注射液能明顯提高腦組織SOD 活性, 減少MDA 的生成( P < 0.01 ) 。

 

2.4 柴胡注射液對小鼠腦組織NO 含量的影響實驗發(fā)現(xiàn), 柴胡注射液400 mg / kg 能明顯提高正常小鼠腦內(nèi)NO 的含量( P < 0.01 ) 。

 

 

學(xué)習(xí)記憶是大腦最高級的功能, 是衡量動物發(fā)育的重要指標(biāo)。國內(nèi)外多采用建立條件反射的方法檢測動物的行為和高級腦功能, 其中Y- 迷宮法廣泛應(yīng)用最為廣泛。本實驗結(jié)果顯示: 柴胡注射液在一定劑量范圍內(nèi)能明顯提高小鼠在Y- 迷宮中的分辨學(xué)習(xí)能力和記憶的影響力; 其易化記憶的效應(yīng)在訓(xùn)練后24 h 最佳, 雖然48 ~ 72 h 有所下降, 但仍明顯地優(yōu)于該時相的生理鹽水對照組, 其中最佳劑量組小鼠伴隨有腦組織中SOD 活性的提高和MDA 水平的下降。SOD 是機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化酶促防御系統(tǒng)中的一個重要酶, 它能特異性清除生物氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基。自由基可引發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng), 過氧化脂質(zhì)的分解終產(chǎn)物MDA 通過交聯(lián)、結(jié)合形成脂褐素, 損傷細(xì)胞膜, 引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙, 在行為上表現(xiàn)為腦功能的衰退。因此, 本研究認(rèn)為柴胡改善小鼠學(xué)習(xí)記憶功能可能與其伴有SOD 活性的提高, 從而增強(qiáng)SOD 終止自由基鏈鎖反應(yīng)的作用, 間接減少MDA 的產(chǎn)生有關(guān), 但具體機(jī)制還需深入探討。本實驗觀察到柴胡注射液最佳劑量組的小鼠腦組織中NO 含量與生理鹽水組相比明顯提高( P <0.01 ) , 提示柴胡改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用可能與其提高腦組織中NO 的含量關(guān)系密切。目前普遍認(rèn)為海馬突觸效應(yīng)的長時程增強(qiáng)( LTP ) 可能是學(xué)習(xí)記憶的突觸機(jī)制, NO 作為逆向信使參與LTP 的形成和維持過程。動物學(xué)習(xí)記憶過程中, 不同腦區(qū)的NO 水平增高, 本實驗結(jié)果與此相符。誠然, 也有研究發(fā)現(xiàn)伴有空間學(xué)習(xí)障礙的小鼠海馬部位的NO含量增多, NO 介導(dǎo)神經(jīng)毒性作用, 從而損傷學(xué)習(xí)記憶功能。筆者推測這可能與NO 具有神經(jīng)毒性和神經(jīng)營養(yǎng)的“雙刃劍樣”作用有關(guān), 當(dāng)NO 含量在合理范圍內(nèi)波動時, 可能介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)作用, 當(dāng)NO 的含量過低或過高時, 則表現(xiàn)為神經(jīng)毒性作用。綜上所述, 適當(dāng)劑量的柴胡注射液在一定時間內(nèi)具有提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的功效, 該作用可能與其伴有腦組織抗氧化能力提高和NO 含量改變有關(guān), 其機(jī)制值得進(jìn)一步探討。