Rene´ Ha¨ gerling1,7, Cathrin Pollmann1,7,Martin Andreas1, Christian Schmidt1,Harri Nurmi2, Ralf H Adams3, Kari Alitalo2,Volker Andresen4, Stefan Schulte-Merker5,6and Friedemann Kiefer1,* The EMBO Journal (2013), 1–16

摘要：在哺乳動物發(fā)育過程中，主靜脈血管中的一個內部細胞亞群開始表達淋巴管特異基因，進而發(fā)育出初級的淋巴結構，被共同命名為淋巴囊。淋巴內皮細胞的出芽，擴展，膨脹被認為是淋巴內皮細胞從主靜脈中產生的基礎，但是淋巴管形成的確切機制仍然不為人所了解。使用選擇性光片照明顯微鏡Ultramicroscope來觀察進行整體免疫染色的小鼠胚胎，我們觀察到細胞分辨率的完整的發(fā)育中的血管系統(tǒng)。本文中，我們報道了可以被檢測到的最早的淋巴內皮細胞松散的連接在主靜脈和淺表的脈管叢。下一步的淋巴內皮細胞聚集導致了兩個清晰的，未被預先確認的淋巴結構，背部外周縱向淋巴管和腹側初級胸導管，它們在后期階段形成了一個與主靜脈的直接連接。我們發(fā)現血管內皮生長因子C和基質組分CCBE1對于淋巴內皮細胞出芽和遷移是必不可少的�？傊�，我們提供了一個明顯更加細節(jié)化的視角和早期淋巴管發(fā)育的新穎模型。

圖1. 初始淋巴祖細胞從主靜脈中產生。
（A-D）受精后9.5/9.75(A,C)和10.5（B，D）天小鼠胚胎血管系統(tǒng)的整體染色。PECAM-1優(yōu)先染動脈、靜脈血管中的內源粘蛋白。Prox1識別的淋巴內皮細胞。（A）中框出了胸頸靜脈區(qū)，淋巴內皮細胞。DA，背主動脈；ISA，節(jié)間動脈；PAAs，咽弓動脈。標尺100um。E 圖示箭頭穿越一對主靜脈之一。靜脈內皮細胞，藍色；發(fā)育中的心臟，暗綠；淺表靜脈叢的位置被標示出來。CCV，一般主靜脈；SV，靜脈竇；H，心臟；ISV，節(jié)間血管。（F）成對CCV和導流入心臟的SV的三維重構。移開一半對稱主靜脈后的ISVs和生肌刀（M）。藍色箭頭指示靜脈血的流動。（G）胸頸靜脈區(qū)的橫切面。DA，ISA和動脈叢標記紅色；CV，ISV和sVP標記藍色。NT，神經管；DRG,背根神經節(jié)；iLECs，初始淋巴內皮細胞。（H-K）整體免疫染色胚胎的圖片左側標注的蛋白分布的光學切片的3維重建。E，受精后幾天的發(fā)育階段（H，I，K橫切面；J矢狀切面）。白色箭頭，新出現的iLECs；點線，CV的背根。標尺100um。（L-O）在E10.0和E10.25期間出現的最早iLECs的圖解。Prox1+細胞，綠色，黃色為細胞核。以綠色表面表明在CCV移開分支中的Prox1表達區(qū)。

圖2. 淋巴內皮細胞從CV的出芽伴隨著細胞和核的形狀改變，以及一個蛋白標記開關的表達。
（A,B）整體免疫染色胚胎的CCV中左側標注蛋白的矢狀視圖。受精后的發(fā)育階段（E）；iLECs初始淋巴內皮細胞；頭蓋處，左；尾部，右。標尺100um。CV的上出口，從鱗狀到紡錘狀的LEC形狀改變（箭頭指示CV根中的Prox1+ ECs）。白色箭頭，iLECs間極薄的連接；紅色箭頭，照亮的靜脈血管中頻繁的發(fā)現紅細胞（但iLECs中從沒有）。（B）也可以看到相應的圖解1O。（C）在E10.5階段，出現的iLECs中的VEGFR-3及其聯(lián)合受體Nrp2水平被上調，而CV和iLECs中的Lyve-1水平保持不變。***P<0.001，NS，不顯著。（D,E）隨著iLECs的出現核的形狀從圓形轉變?yōu)闄E圓形。通過核表面重構描述了CCV內部和外部的Prox1+細胞核以及對球率和橢球率做散點圖（E）。標尺100um。（F-H）矢狀（F）和橫切面（G，H）視圖中整體免疫染色小鼠胚胎的CCV內部和外部的Prox1+細胞核表面重構。（F，G）通過熱成像賦以偽色標記的Prox1表達強度圖，例如，最高強度的表達標記為紅色，低強度表達標記為藍色。（H）通過圖像的疊加進行細胞的解剖學定位軟件包：Imaris Vantage，標尺100um

圖3. iLECs在節(jié)間血管主要分支的水平上濃縮來形成照亮的外周縱向淋巴管（PLLV）。
（A-D）每張圖所展示蛋白的整體免疫染色胚胎光學切片的矢狀圖重構。E，受精后的發(fā)育天數；頭蓋的，左；尾端的，右。（A）在iLECs出現的早期階段，iLECs以扇形模式分布，從CCV向頭部和尾部擴展。虛線，iLECs檢測的邊界。（A-D）iLECs在節(jié)間血管側枝的水平上立即濃縮形成PLLV。長的陰影線指示了CCV和SV的位置；短的陰影線，iLECs濃縮和PLLV形成的區(qū)域。（E-H）圖解iLECs的位置，在E10.5和E10.7階段出現在CV的背部。CCV之外的Prox1+iLECs以淡綠色標記，CV內的Prox1+細胞和心肌以深綠色標記。在CCV移開的分支中的Prox1表達域（P1ED）以淡綠色表面顯示。淺表靜脈叢作為iLECs的一個可能的備選來源，其位置標注為藍色（G，H）。sVP內的Prox1+內皮細胞被標注為紅色。sVP，淺表靜脈叢；標尺100um

圖4. CV和PLLV之間的LECs聚集并形成不斷增長的更大的被照亮結構并最終形成原始的胸導管。來自整體免疫染色的小鼠胚胎光學切片的圖中標注蛋白的（A-C）矢狀圖和（D）截面圖。
（A)箭頭指示了位于CV和PLLV之間的LECs快速和不斷進行的聚集，這導致了更大照明結構pTD的形成（B-D）。（C，D）淺表淋巴管sLECs開始從PLLV背側和pTD旁邊伸展。PLLV和pTD在pTD頭蓋端連接到一起。（F-H）圖示了導致pTD成形的細胞聚集和濃縮事件。（I）在E11.5階段，sLECs中的VEGFR-3和它的聯(lián)合受體Nrp2水平上調，而Lyve-1水平與CV和iLECs相比強烈下調。***P<0.001。發(fā)育階段（E）；頭蓋，左，尾端，右。ACV，前主靜脈；CCV，一般主靜脈；PCV，后主靜脈；ISV，節(jié)間靜脈；PLLV，外周縱向淋巴管；pTD，原始胸導管；sLECs，淺表淋巴結。標尺100um

圖5. 通過最高水平表達的Prox1表征的pTD和CV間新形成的成對的接觸點。
（A-C）整體免疫染色胚胎的矢狀圖。新形成中的pTD快速鞏固進一個巨大的照明結構，頭顱部以U形連接到PLLV（左側A，B）。CV和pTD間的兩個連接表達最高水平的Prox1（箭頭）。（B-E）一個總是位于pTD和CV連接間的作為鎖骨下動脈的短暫存在的側枝被星號標記出來。（C）紅色箭頭：pTD內堆積的紅細胞。箭頭標注pTD連接端對面的Prox1+細胞。（D，E）通過pTD和CV連接區(qū)域的單個平面（光學切片）。（F-H）圖示pTD和CV間接觸點的發(fā)育，接觸點處高表達的Prox1+細胞標記為暗綠色和紅色的細胞核。標尺100um

圖6. 不同的淋巴內皮細胞群表達不同的標記蛋白組。
（A-G）所示發(fā)育階段的免疫染色胚胎的橫向冷凍切片�？梢姷目乖�被以每幅圖上所標記的相應顏色標記。典型例證標記表達的面板在（I）中匯總。（A）在E10.0階段的LECs細胞中沒有粘蛋白的表達，在E11.0階段首先被檢測到并在E12.0的LECs中變得豐富。注意CV中的Prox1+細胞在所有階段都是陰性。在E11.5階段，Nrp2在CV和pTD內中等強度的表達，而CV外的iLECs強烈的表現為陽性。（C）內皮粘蛋白在iLECs中只有短暫的留存。（D）在CV和pTD的Prox1+ ECs中Lyve-1強烈表達，而在展示的sLECs中僅有殘留的表達（箭頭）。（E）在所有血管結構中，整合蛋白α6有中等程度的表達。（F）在E11.5階段，神經生長因子Netrin-4在BECs中強烈表達，在CV中很弱的表達，在pTD內中等程度的表達，但在iLECs中（箭頭）沒有被檢測到。（G，H）Unc5B在iLECs（G，箭頭）和sLECs（H，箭頭）中強烈表達，而在pTD中表達微弱。 (H)來自整體免疫染色的小鼠胚胎的Prox1 (綠) 和Unc5B (藍)光學切片的矢狀重構. (I)在妊娠中期，不同LEC群中標注蛋白的表達。數據來自免疫染色的冷凍切片或整體免疫染色。表示的結構和細胞群： CV, 主靜脈; iLECs, 初始LECs (輪從CV中出現的紡錘狀LE,松散連接的細胞); sLECS, 淺表LECs (從PLLV (背側)中伸出的LECs); pTD, 初始胸導管. CV*, 對CV背側Prox1+細胞的表達限制。標尺100um

圖7. CCBE1缺陷導致的Prox1+細胞從CV分離的失敗，并導致初始淋巴結構的快速損失。

Figure 8

VEGF-C（血管內皮因子C）缺陷的小鼠胚胎中的Prox1+內皮細胞因為不能離開它們起源處的血管從而標記了LECs的靜脈來源。E10.75階段野生型(A, B)和Vegfc_/_型(C–F)胚胎的矢狀圖3D重構，對標注蛋白做了整體免疫染色。在VEGF-C缺陷胚胎中，Prox1+內皮細胞不能離開靜脈血管導致沒有出現發(fā)育中的淋巴結構。(E, F) 除了CV（箭）中的Prox1+ 細胞, 在腹側sVP（箭頭）處更大的靜脈血管中捕獲了第二群Prox1t淋巴初始組織 。(G, H) 圖示了野生型 (G) 和VEGF-C缺陷型(H)胚胎中的Prox1+細胞。NE, 神經元的Prox1+表達條紋。sVP, 淺表靜脈叢。標尺100 um

Figure 9. 在iLECs外出和淋巴管形成過程中，CCBE1和VEGF-C協(xié)同的相互作用。
對E10.5階段所標注蛋白整體免疫染色的野生型(A–C), Vegfct/_ (D–F), Ccbe1t/_ (G–I) 和 Vegfct/_/Ccbe1t/_ (J–L) 胚胎矢狀圖的3維重構。CCV和ISVs的根部用虛線標注，Prox1+細胞用箭頭標注。與野生型同窩小崽相比，Vegfct/_胚胎(A–C)表現出iLECs從CCV中遷出的下降(D, E)。與之相反，Ccbe1t/_胚胎中，受損的ISVs形成被檢測到。而且，不典型的，照亮的分支出現在Prox1+和高水平VEGFR-3表達的主靜脈根部(G–I). (J–L) 在復合的雜合胚胎中，這種表型非常夸張地表明了VEGF-C 和CCBE1在淋巴管形成過程中的協(xié)同作用。標尺100um