摘要: 　
目的　建立可靠的自由活動大鼠長期靜脈輸液通路。方法　在前人的基礎上,對自由活動大鼠靜脈通路的建立進行了改進和有益的探索。

結果　70 %的實驗大鼠能順利完成為期一個月的非連續(xù)輸液實驗,手術死亡率、感染率和管理脫落率較低。結論　本文所建立的大鼠靜脈輸液通路實用可靠。

關鍵詞:大鼠; 自由活動; 靜脈輸液通路　醫(yī)學科研活動需要各種動物模型,很多模型需在動物身上建立一條長期輸液的靜脈通路,并且要求能在動物清醒、自由活動時輸液或采血[1 ] 。最常用的動物為大鼠,也有猴、豬、兔和小鼠等[2～4 ] 。臨床上體液支持、靜脈營養(yǎng)支持、靜脈血壓監(jiān)測、嚴重創(chuàng)傷、多臟器功能障礙、物質成癮的動物實驗均需建立靜脈通路[3 ,5 ,6 ] 。本文在前人的基礎上,介紹一種可靠的、相對經(jīng)濟的大鼠靜脈通路建立和維護的技術。

　　清潔級雄性Sprague2Dawley (SD) 大鼠30 只,手術時3 月齡,體重250～300 g ,由中南大學湘雅二醫(yī)院動物實驗室提供。

2.1 　插管以及輸液轉軸

管道包括靜脈留置聚氨酯管( Polyurethane Intravascular Tubing) BPU-T30 , 內徑0.58 mm ,外徑0.91 mm。聚乙烯管BPE-T20 ,內徑0.38 mm ,外徑1.09 mm ,這種規(guī)格的聚乙烯管管壁較厚,可抵抗一定強度的外力撕扯。輸液管(COEXTM Tubing , BCOEX-T22 ) , 內徑0.61 mm , 外徑1.60 mm。這種輸液管內層為聚乙烯PE ,阻力小,液體通過流暢,化學性質穩(wěn)定,不會與輸液成分發(fā)生化學反應;外層為聚氯乙烯PVC ,抗撕扯性、耐久性好。整個輸液系統(tǒng)的一個關鍵設備即輸液轉軸,既要能使液體通過,又要能使大鼠在籠中自由活動。輸液轉軸很好地解決了這一問題,它使液體通過的同時自身能做360 度旋轉,阻力很小,加一個力臂,大鼠可輕松地在籠中活動。本實驗所用的輸液轉軸型號為375/22 ,如圖1 ,死腔(Dead volume) 為8μL ,摩擦力矩(Frictional torque) 為0.030 盎司2英寸oz-in (約2.160 g/cm) 。

兩端可接輸液管,右下部白色橫桿為力臂,借助彈簧管與大鼠背部相連,注意兩端為表面光滑的管道,沒有螺紋,螺紋應為照片不清晰所致。

2.2 　固定和保護裝置

要防止大鼠撕咬輸液管道,必須要有保護和固定裝置,輸液轉軸到大鼠背部的輸液管道從一根25cm 長的彈簧管(電爐絲) 中間通過,彈簧管上端連輸液轉軸,下端連一個塑料件。大鼠輸液在其兩前肢上穿上一個由粘合布做成的馬甲,馬甲背部有一個塑料件,該塑料件可與彈簧管下端的塑料件對接,并有一個扣合裝置。輸液管從彈簧管內經(jīng)塑料件到大鼠皮下再到頸外靜脈,整個輸液管無外露部分,故能有效防止大鼠撕咬。整個通路如圖2 所示,但固定帶(Harness) 由自制的馬甲代替。

2.3 　術前準備

將BPU 管剪成4 cm 長小段,BPE 管剪成10 cm長,BPU 管用三氯甲烷泡粗,一端套在BPE 管外面1cm ,組成13 cm 長管道。在連接部打一圈結,使之成“L”形,由于有一圈結,在“L”的拐角處有一個小圈。將做好的管子用75 %酒精浸泡消毒,并用生理鹽水沖洗,手術前用生理鹽水浸泡備用。1 mL 注射器針頭作平頭備用。準備眼科手術器材一套,硬膜外穿刺針一根,以便于在鼠背部與頸部打皮下隧道。

3.1 　分離靜脈

大鼠手術時體重以250～280 g 為宜,用4 %戊巴比妥鈉50 mgPkg 麻醉,同時給予阿托品013 mg/kg ,手術過程及術后注意保溫。大鼠背部平肩胛處備皮,剪一小口,約1～2 mm 長,以備插管從背部穿出。翻轉大鼠,頭朝術者,頸部右側備皮。從下頜至鎖骨上緣縱形剪一小口,約2 cm 長,分離皮下組織,找到右側頸外靜脈(有的實驗可選用股靜脈[7 ] ) 并分離,滴適量生理鹽水,防水干燥。

3.2 　插管

結扎靜脈遠心端,用眼科剪在靜脈上剪一“V”形口,勿剪斷靜脈,先用一小段BPE-T10 管(內徑0.28 mm ,外徑0.60 mm) 插入靜脈,因該管很細,插入較容易,再用BPE-T10 將“V”形口挑大一些,“L”形管遠端連1 mL 注射器,注射器針頭為平頭,插管前端剪成斜面,管內注滿生理鹽水。用鑷子夾住BPU-T30 插入“V”形口,插入靜脈3.5～4.0 cm。

3.3 　固定插管

在靜脈上打結固定插管,因為血管內的插管有1 cm 的BPU 管是套在BPE 管外面,而BPE-T20 管壁較厚,故在此段血管上打結可稍用力,使固定牢固,而不用擔心管腔會被扎閉。用手術縫針在插管小圈內連線,將其縫在血管旁邊的肌肉上,線圈要稍寬松,以防肌肉壞死。

314 　打隧道及縫合、穿馬甲

用硬膜外穿刺針從頸部切口到背部小口打皮下隧道,取下1 mL 注射器,插管從隧道穿出大鼠背部,再次連上1 mL 注射器,倒抽回血確認插管在血管內,縫合頸部切口。從插管中打入20 萬u 青霉素,用堵頭套在插管末端,給大鼠穿上馬甲;由于麻醉時大鼠身體較軟,馬甲不可穿是過緊,以防大鼠窒息。將大鼠放入單養(yǎng)籠,保溫至其蘇醒。

　　手術后大鼠休養(yǎng)3 d ,每日從靜脈插管注入20萬u 青霉素,隨后可每日給予10 萬u。給藥同時即可起到通暢管道作用。肝毒可不作為常規(guī)用藥,如發(fā)現(xiàn)通道壓力增加時可臨時給予肝素200～500 u。實驗時將大鼠放入輸液籠。自身給藥實驗采用行為操作籠及相應的行為軟件控制。將輸液管與注射泵相連,大鼠背部的PE 管與彈簧管內的輸液管對接,輸液完成后可將大鼠從輸液籠中取出,BPE 管末端套上塑料堵頭,放入飼養(yǎng)籠中單養(yǎng)。輸液時大體如圖3 所示。

因本輸液系統(tǒng)大鼠不輸液時回到飼養(yǎng)籠,故每次連接管道時要排盡管管道中的空氣,避免空氣栓塞,并注意無菌操作。

　　30 只大鼠手術麻醉時死亡1 只,術后次日死亡2 只,余下27 只中途5 只發(fā)生管道堵塞,無一例感染發(fā)生,共有22 只完成為期1 個月的自身給藥實驗。

　　發(fā)達國家在實驗研究中給小動物輸液有40～50 年的歷史[8 ] ,自從輸液轉軸由Michael Loughnane(隨后他將其商業(yè)化并成立了INSTECH SOLOMON公司) 于上個世紀60 年代發(fā)明之后,眾多的商業(yè)公司相繼開發(fā)了許多給動物輸液的配套產(chǎn)品,例如適于各種動物的規(guī)格繁多的導管、輸液轉軸、固定裝置、注射泵、籠子、軟件等。國內在這方面也有近20 年的歷史,少數(shù)科研單位對此技術進行了有益的探索,并設計了一些價廉實用的裝置[6 ,9～11 ] 。

在實驗中給動物輸液有幾個環(huán)節(jié)比較關鍵,一是輸液管道和輸液轉軸,二是插管的固定和連接方法,三是輸液時對管道的保護及減少大鼠自由活動的障礙,四是術后的維護。從這幾個方面看,國內報道的系統(tǒng)有一些問題。比如從注射泵到大鼠靜脈的輸液管道全部采用硅膠管[12 ] ,口徑也不盡相同,有外徑019 mm、112 mm 等。硅膠管能有效減輕排斥反應,但材質柔軟,如全程采用硅膠管,一是插入靜脈后結扎時不能扎緊,否則有扎閉管道的危險[12 ] ,從而管道易脫落;二是管道在輸液時盡管外面有彈簧管保護,仍有被拉伸擴張的可能,造成給藥量不準,這一點對于自身給藥實驗尤其重要,因為自身給藥實驗為非連續(xù)輸液,每一次給藥劑量較小,要求系統(tǒng)能準確及時地將微量藥物泵入動物體內;三是全程采用硅膠管者一般管道不會中斷,大鼠手術完成后即24 h 呆在輸液籠內,直至整個實驗結束。這樣大鼠背帶彈簧管,容易抑制其自主活動;如果實驗中間更換藥物也極不方便;管道意外破損也難以補救;不給藥時亦不能進行其它實驗,例如行為實驗條件性位置偏愛等[3 ] 。本實驗大鼠體內管道采用BPU 管與BPE 管連接,BPU 排斥反應與硅膠管相似,BPE 管堅固,從而有效解決了上述問題。輸液轉軸,這一輸液系統(tǒng)中最有技術含量的環(huán)節(jié),國內企業(yè)尚無類似產(chǎn)品出售。許多文獻報道的輸液系統(tǒng)均采用自行設計的類似裝置,比如用活動套管和軸承做成注射器樣的結構,或頭皮針在橡膠中轉動來實現(xiàn)輸液時360 度旋轉等[9 ,13 ,14 ] 。這些設計難免會出現(xiàn)漏液、阻力大、死腔大等缺陷,長期實驗困難較大。插管在大鼠體內的固定與插管的關系前已述及,插管從大鼠背部穿出后,用馬甲固定,插管與大鼠背部垂直,能避免大鼠撕咬。馬甲與彈簧管利用塑料件可方便地實現(xiàn)對接與分離。有的系統(tǒng)將彈簧管末端擴成螺圈,將螺圈縫在大鼠背部[10 ,15 ] ,這樣大鼠容易感染,活動時也有疼痛感。彈簧管的長度與籠子的大小要匹配,以避免彈簧過松或過緊�；\子的空間也不能過大或過小,本實驗操作籠大小為30 cm ×30 cm ×30 cm。輸液時裝輸液轉軸的吊桿可利用杠桿原理,在支點后裝一合適的負荷,因大鼠的力臂長,能有效減輕或抵消大鼠活動時背部的負載。注意雖然輸液轉軸可以360度旋轉,大鼠仍然只能實現(xiàn)相對的自由活動,翻滾旋轉運動則受到限制。大鼠靜脈長期給藥是一項復雜的實驗技術,不僅手術有一定難度,整個輸液設備均有特殊要求,每個細微的環(huán)節(jié)都可能影響整個實驗的結果,本文所報道的方法有一個明顯的缺點,就是大量使用國外的相關產(chǎn)品,購買不方便,但卻是目前保證實驗順利進行的明智選擇。也只有使用規(guī)范的實驗裝置,才能得到準確可靠的實驗結果,易于被其它的實驗室驗證,從而獲得同行的公認。