Rob Darrington，Genevac Ltd.，英國伊普斯威奇市

 

干燥高效液相色譜（HPLC）純化餾分（主要成分為水和乙腈）是眾多實(shí)驗(yàn)室中一項(xiàng)常見且重要的實(shí)驗(yàn)任務(wù)。實(shí)驗(yàn)的要求是將樣品干燥成粉末狀，以便準(zhǔn)確稱量樣品、進(jìn)行二次取樣或再次溶解。因此，冷凍干燥是實(shí)驗(yàn)的首選技術(shù)，但是常規(guī)的大型冷凍干燥系統(tǒng)可能難以處理有機(jī)溶劑，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑很容易在樣品中暴沸，并因此損壞真空泵，造成樣品損失。Actelion Pharmaceuticals采用Genevac公司¹ 開發(fā)的快速凍干法（LyoSpeed™），使用Genevac HT-12離心蒸發(fā)儀來完成這項(xiàng)工作。LyoSpeed方法通過離心機(jī)來控制樣品的沸騰情況，使有機(jī)溶劑濃縮，并避免樣品損失，然后從冷凝器中抽出有機(jī)溶劑，使剩余的水份凍干。這種方法對于親水性樣品而言非常有效，但如果樣品不能溶于水，已經(jīng)去除有機(jī)溶劑的樣品將會潰散，甚至?xí)�形成油脂狀。這些樣品則需要更進(jìn)一步的處理才能形成所需的干粉狀態(tài)。

 

標(biāo)準(zhǔn)化合物庫的平均操作成功率（完全凍干vs油性化合物）約為50％。根據(jù)化合物的不同屬性，最低和最高操作成功率可分別達(dá)到30％和90％。取得較高操作成功率的簡單方法，就是讓樣品凍干并使乙腈仍然保留在樣品中。遺憾的是，現(xiàn)有的設(shè)備還無法實(shí)現(xiàn)這樣的操作效果。

 

在硬件上也存在一定的限制因素，尤其是HT-12蒸發(fā)儀中溶劑冷凝器（VC3000）表現(xiàn)出的溫度特性。VC3000可以達(dá)到的最低溫度為-50°C，這就限制了蒸發(fā)系統(tǒng)可以達(dá)到的真空度。為了取得良好的凍干效果，真空度應(yīng)盡可能低，最理想的狀態(tài)是能夠達(dá)到0.1mbar以下。例如，0.5mbar壓力條件下純凈水的沸點(diǎn)為-32℃，但乙腈在同等真空條件下的沸點(diǎn)可降至-61°C，因此會在煮沸時噴出冷阱和堵塞真空泵，導(dǎo)致蒸發(fā)系統(tǒng)中的壓力上升。壓力上升會提高溶劑的沸點(diǎn)，致使凍干效果不理想，甚至?xí)��?dǎo)致凍干過程徹底失敗。使用LyoSpeed方法的目的不在于使樣品徹底凍干（如生產(chǎn)疫苗），而是要制出非油狀干燥粉末。正如真正的凍干過程一樣，只有實(shí)現(xiàn)更好的真空度，才能獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 

 

問題的解決辦法很明確，即實(shí)驗(yàn)室需要更能制冷的冷凝器，以便在低真空度條件下使樣品濃縮并保留住乙腈成分。 研究人員與Genevac公司的工程設(shè)計團(tuán)隊(duì)合作，通過連接至HT-12蒸發(fā)器的VirTis Benchtop K -85°C冷凍干燥機(jī) (BTK)，對 VC3000 冷凝器進(jìn)行了一系列的基準(zhǔn)測試。工作團(tuán)隊(duì)根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，開發(fā)出了命名為VC6000（圖1）的HT-12新型冷凝器。 VC6000的設(shè)計根據(jù)BTK的構(gòu)造演變而來，具有更強(qiáng)的冷凝功效、可縮短除霜時間，且具有Genevac系統(tǒng)耐溶劑性。

 

圖 1 – 連接VC6000冷凝器的Genevac HT-12蒸發(fā)系統(tǒng)

進(jìn)行測試的Genevac HT-12蒸發(fā)系統(tǒng)與VC3000，BTK或VC6000冷凝器相連。10ml樣品成分為水和乙腈混合物（體積比為50:50），制備樣品的容器為直徑16mm高度100mm的玻璃瓶，管壁厚度為1.2mm。堅實(shí)的PVDF塑料樣品架放置于HT-12蒸發(fā)器的翼側(cè)，并裝有24支玻璃試管。每支玻璃試管中的溶劑成分為： 非化合物，或20mg Diovan或市售的20mg其他化學(xué)物質(zhì)，以及親脂性材料鄰苯二甲-β-丙氨酸（AI028492）。Diovan和AI028482都是較難從HPLC餾分中凍干的樣品，因此這樣的組合形成了“最難處理”的樣品。在兩種負(fù)載情況下測試每一款冷凝器。一種情況采用4架樣品（96支試管），另一種情況采用12架樣品（滿載288支試管）。

 

所有樣品和每一款冷凝器都采用相同的方法：

1.    利用Dri-Pure®真空坡道控制樣品沸騰/暴沸情況，操作時長為 1小時

2.    無熱全真空處理，操作時長為3小時

3.    在40°C溫度條件下對樣品架進(jìn)行全真空熱處理，操作時長為4小時

4.    全真空無熱處理，操作時長為18小時

第4階段的處理時間很長，采用這種方法進(jìn)行測試，實(shí)際的干燥時間可由記錄的數(shù)據(jù)圖表獲取。

 

凍干之后，需要對每一試管中的化合物狀態(tài)進(jìn)行評估，確定其是否已成功凍干為散干粉，或已經(jīng)形成含有少量油質(zhì)的樣品，或是每一試管中是否仍有殘余溶劑。 干燥時間可被視為溫度匯聚到樣品架和樣品上的時間。

圖 2– 每一測試條件下的凍干結(jié)果

Test System：測試系統(tǒng)

Number of Tubes: 試管數(shù)量

Compound: 化合物

Drying Time （Minutes）：干燥時間（分鐘）

Count of Condition of Sample after Drying : 干燥后的樣品狀態(tài)

Light Oily:少量油脂

 

如果凍干之后沒有發(fā)現(xiàn)殘余樣品，則達(dá)到100％的測試成功率。因此，放置于BTK的96份樣品中仍有2份樣品沒有干燥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果出人意料。由于此結(jié)果并未在較高樣品負(fù)載量的實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)出現(xiàn)，因此沒有作出進(jìn)一步調(diào)查，并將其視為異常實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 

VC3000冷凝器處理實(shí)際樣品時的操作成功率最低。Benchtop K的操作性能更好，但因其內(nèi)部容積過小而無法同時對288支試管進(jìn)行凍干處理。VC6000冷凝器的操作性能最佳，這與預(yù)期的結(jié)果相一致。以下兩點(diǎn)值得注意：

1.    為什么附帶Diovan的VC6000冷凝器在樣品低負(fù)載量和高負(fù)載量兩種情況下表現(xiàn)出不同的操作性能？ 樣品低負(fù)載量情況下所需的干燥時間也更長，這與預(yù)計的結(jié)果截然不同。

2.    在每一項(xiàng)試驗(yàn)中，處于每一位置的樣品成分完全相同，并且均取自同一儲備溶液，但為什么每支試管之間的干燥性卻如此不同？

 

查看實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖時（如圖3a和3b所示），可明確地找出使用VC6000進(jìn)行兩項(xiàng)樣品（含Diovan成分）實(shí)驗(yàn)得出不同結(jié)果的原因。圖3a顯示出較輕的樣品負(fù)載量，黃線表示樣品溫度，這不會與表示樣品架溫度的粉色線相交叉。這表明樣品仍然潮濕，如同實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示。 

圖 3a – VC6000冷凝器上帶有Diovan較輕樣品負(fù)載量（96個樣品）的數(shù)據(jù)圖

 

造成此實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因無法立刻得知，從而需要作出進(jìn)一步調(diào)查。其約1.5mbar的真空度不足使樣品凍結(jié)和完全干燥。導(dǎo)致問題的根本原因在于渦旋真空泵（Scroll pump）的性能略有下降。對于處理有機(jī)溶劑蒸汽的系統(tǒng)而言，渦旋泵（Scroll pump）無疑是最佳選擇，而且不會產(chǎn)生損壞真空泵的油脂。正如所有真空泵操作一樣，為了確保最佳的操作性能和取得最好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須對泵進(jìn)行定期維護(hù)。對于渦旋泵的日常維護(hù)，需要每隔3個月就檢查一下端部密封件，以確保性能良好、易于操作并且減少污染。

圖 3b – 帶Diovan的VC6000冷凝器上較高樣品負(fù)載量（288個樣品）數(shù)據(jù)圖

 

如果需要研究處理相同樣品的三種不同冷凝器的壓力曲線，只要在較高負(fù)載量中使用純?nèi)軇�，如圖4所示，功率更大更制冷的冷凝器（VC6000）能夠?qū)�壓力保持在較低水平，這表明冷凝器具有極強(qiáng)的冷凝溶劑 功能。實(shí)現(xiàn)成功的冷凍干燥，最重要在于保持所需的低壓條件，而決定這一條件的至關(guān)重要的兩個元素即好的真空度和功能強(qiáng)大并充分制冷的冷凝器。

 

圖 4 – 高負(fù)載量條件下3處冷阱的壓力性能數(shù)據(jù)圖

工作人員在每一項(xiàng)測試中都謹(jǐn)慎地使用潔凈的全新玻璃器皿、溶劑和樣品，因此可排除污染的可能性。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的另一種解釋是，由于化合物本身在樣品表面形成了覆膜，因此可能阻礙或完全阻塞蒸發(fā)過程。冷凍干燥系統(tǒng)的使用者細(xì)致地描述了“濾餅阻力（cake resistance）”的概念，覆膜的厚度也可能隨著樣品深度的加大而增加。干燥化合物庫的實(shí)際研究結(jié)果顯示，樣品表面形成的覆膜會對干燥造成阻礙，以致會殘留幾毫升液體。樣品研究工作人員報告稱，具有特定化學(xué)性質(zhì)的部分化合物庫在表面容易形成覆膜。對于使用AI02492（圖5）進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作，少數(shù)樣品無法干燥的原因至今不明。雖然形成覆膜可能是導(dǎo)致此結(jié)果的一個原因，但這無法解釋為什么只有14份樣品無法干燥，而另外274份樣品則完全干燥。

 

圖 5 –高負(fù)載量試驗(yàn)條件下使用AI02492 （連接VC6000）凍干后潮濕試管的位置

說明 – 黃色 = <0.5ml  紅色= <4.5ml  白色 = 干粉

 

 

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比測試所用的其他系統(tǒng)，VC6000具有更卓越的冷凍干燥性能（尤其是在高負(fù)載量情況下）。系統(tǒng)的真空度是取得良好實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素，這需要一個密閉的真空系統(tǒng)和功能強(qiáng)大并且充分制冷的冷凝器。VC6000冷凝器已被用于執(zhí)行日常工作流程，在對于溶解方式高度變化（一些是在90%有機(jī)溶劑中洗脫，一些是在90%水中洗脫）的多種化合物構(gòu)建的“真實(shí)化合物庫”來說，也會出現(xiàn)類似的蒸發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。甚至現(xiàn)在一些樣品是放置在鋁制樣品架進(jìn)行處理，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然是一樣的。

 

作者衷心感謝瑞士阿爾施維爾Actelion Pharmaceuticals公司化工部的高級實(shí)驗(yàn)室研究人員Viktor Ribic，感謝他長久以來所做的研究工作，以及為本文提供寶貴的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

 

1.  Developments in Laboratory Scale Lyophilisation for Purification Laboratories.  

Induka Abeysena 博士，Rob Darrington, 2006,可通過查閱

 

適合HPLC餾分的一項(xiàng)先進(jìn)的凍干技術(shù) (128次)    An improved lyophilization technique for HPLC fractions (41次)