Joerg Martini a,1, Katja Schmied b,1, Ralf Palmisano b, Katja Toensing a,

Dario Anselmetti a,¤, Thomas Merkle b

a Department of Experimental Biophysics and Applied Nanoscience, Faculty of Physics, University of Bielefeld, 33615 Bielefeld, Germany

b Department of Genomic Research, Faculty of Biology, University of Bielefeld, 33594 Bielefeld, Germany

Received 11 August 2006; received in revised form 20 December 2006; accepted 21 December 2006

Available online 17 January 2007

    我們運(yùn)用多焦點(diǎn)雙光子激光掃描顯微鏡來(lái)進(jìn)行局部和選擇性的蛋白激活以及細(xì)胞內(nèi)蛋白動(dòng)態(tài)的的量化調(diào)查。局部激活使用光激活綠色熒光蛋白(pa-GFP)和光學(xué)雙光子激發(fā)來(lái)實(shí)現(xiàn)，以調(diào)查實(shí)時(shí)原位的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)。這個(gè)過(guò)程對(duì)于深入理解和建�；罴�(xì)胞內(nèi)的調(diào)控和代謝過(guò)程極其重要。作為范例，既包含了一個(gè)核輸入信號(hào)又包含了一個(gè)核輸出信號(hào)的擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子LHY/CCA1-like 1 (LCL1)被定量化調(diào)查。我們使用了由質(zhì)粒編碼的光激活綠色熒光蛋白(pa-GFP)融合蛋白和一個(gè)紅色熒光轉(zhuǎn)染標(biāo)記聯(lián)合轉(zhuǎn)染的煙草BY-2原生質(zhì)體，并pa-GFPLCL1在核內(nèi)光激活后的快速向核外輸出。作為對(duì)照，一個(gè)LCL1核輸出陰性突變體仍然被束縛在核內(nèi)。我們確定了由激活pa-GFP-LCL1的雙向核運(yùn)輸和pa-GFP的擴(kuò)散分別導(dǎo)致的核內(nèi)熒光下降的51s和125s的平均時(shí)間常數(shù)

    Pa-GFP的激活和熒光的原位檢測(cè)，通過(guò)基于根據(jù)蛋白動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)需求改進(jìn)的商業(yè)化系統(tǒng)(TriM-Scope, LaVision-Biotec; Martini et al., 2005; Nielsen et al., 2001)多焦點(diǎn)2光子LSM檢測(cè)(Fig. 1). 64焦點(diǎn)2光子LSM (Martini et al., 2006)包括一個(gè)倒置光學(xué)顯微鏡和一個(gè)可以產(chǎn)生從760nm到960nm的100fs激光脈沖的由固態(tài)激光器泵浦的鎖模飛秒Ti:Sa激光器。用于激活和成像循環(huán)的波長(zhǎng)選則通過(guò)一個(gè)允許5s內(nèi)轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)的ahome-built screw motorization來(lái)實(shí)現(xiàn)。

    激光掃描單元(TriM-Scope, LaVision-BioTec) 包括一個(gè)內(nèi)置的預(yù)啁啾部分以補(bǔ)償激光脈沖的色散，一個(gè)光束分光器部分和振鏡掃描器。通過(guò)選擇一組10個(gè)100%反光鏡和50%分光鏡，激發(fā)的NIR激光束在樣品中被分為1, 2, 4,……, 64個(gè)激發(fā)焦點(diǎn)。這些數(shù)目可調(diào)的焦點(diǎn)在顯微鏡物鏡(UPLAO60XW3/IR, NAD1.2;Olympus)的焦平面上被激光掃描單元中的2個(gè)掃描鏡掃描。整個(gè)激活和測(cè)量過(guò)程在一個(gè)溫度可控環(huán)境中在293±1K下進(jìn)行。因?yàn)樵诒３置總�(gè)焦點(diǎn)的能量沉積低于樣品的退化極限的同時(shí)，多個(gè)焦點(diǎn)產(chǎn)生了相對(duì)高的雙光子誘導(dǎo)熒光產(chǎn)額，成像可以30ms的時(shí)間分辨率進(jìn)行。圖像用一個(gè)背照明的EMCCD相機(jī)(IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology)以non-descanned方式獲取。激發(fā)的NIR激光束被引導(dǎo)通過(guò)一個(gè)分光鏡 (2光子-Beamsplitter, Chroma)到物鏡的后光圈上。為了成像深度和光譜熒光切片，倒置顯微鏡采用了機(jī)械聚焦驅(qū)動(dòng)(MFD, Marzhauser)和一個(gè)程序控制濾波輪(LaVision-BioTec)。數(shù)據(jù)獲取和實(shí)驗(yàn)控制由 TriM Scope的軟件包Imspector(LaVision-BioTec)執(zhí)行。操作和處理5維的數(shù)據(jù)列，包括光譜和時(shí)間數(shù)據(jù)軸，使用軟件包Imspector (LaVision-BioTec)，ImageJ (Rasband, 1997) 或 Imaris (Bitplane).

Fig. 1.多焦點(diǎn)2光子激光掃描顯微鏡的原理圖(1) Tsunami Ti:Sa 激光器(波長(zhǎng)可調(diào))由固態(tài)Millenia X 激光器泵浦 (均來(lái)自 Spectra Physics), (2) 多焦點(diǎn)激光掃描單元 (TriM-scope, LaVision BioTec), (3) 分光鏡 (2光子-Beamsplitter, Chroma), (4) 短波通過(guò)濾波輪 (2光子-Emitter, Chroma), (5) 物鏡 (UPLAO60XW3/IR, NA D 1.2; Olympus), (6) 樣品中可選擇數(shù)目的熒光焦點(diǎn), (7) 倒置光學(xué)顯微鏡(IX 71, Olympus), (8) 濾波輪 (濾波輪, LaVision BioTec)裝備帶通濾波片 D 605/55 (Chroma)用于檢測(cè) Ds-Red 和 HQ525/50 結(jié)合 HQ510/20 (均來(lái)自 Chroma)以檢測(cè) pa-GFP, (9) 背照式 EMCCD-camera (IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology) 在NDD光路中, (10) 熒光燈 (HBO 50, Zeiss), (11) 帶通激發(fā)濾波輪 D 540/25 (Chroma) 用于 Ds-Red 或帶通激發(fā)濾波輪HQ 480/20 (Chroma) 用于 pa-GFP.

Fig. 2.含有核輸入輸出信號(hào)的擬南芥轉(zhuǎn)錄因子LCL1 (分別為NLS, NES). 由質(zhì)粒編碼GFP融合蛋白轉(zhuǎn)染的煙草BY-2原生質(zhì)體。通過(guò)單光子共聚焦激光掃描顯微鏡分析的GFP融合蛋白穩(wěn)定態(tài)定位。(a) GFP-LCL1 揭示的核與細(xì)胞質(zhì)間的分區(qū)

 (b) 使用核輸出抑制劑leptomycin B (LMB)孵育后，由于功能性NLS的存在，GFP-LCL1的穩(wěn)定態(tài)分區(qū)劇烈轉(zhuǎn)化為幾乎完全分布于核中。 (c,d) 對(duì)照，LMB對(duì)單獨(dú)的GFP沒(méi)有影響。 (e) GFPLCL1(NESm)中，它的NES的點(diǎn)突變?cè)斐傻腖CL1的核輸出活性削弱同樣導(dǎo)致了GFP融合蛋白在核內(nèi)的聚集。(f) 與(e)中同一個(gè)原生質(zhì)體的透射光與GFP熒光成像的疊加標(biāo)尺為10um (g) 作為對(duì)照的 GFP-NLS 在核內(nèi)的增加。 (h) 同一原生質(zhì)體的GFP-NLS綠色熒光蛋白和作為轉(zhuǎn)染標(biāo)記的Pra1-DsRed (At2g38360)紅色熒光蛋白的疊加。

Fig. 3. pa-GFP 在一個(gè)活原生質(zhì)體內(nèi)的自由動(dòng)態(tài)擴(kuò)散。選出的5幅表達(dá)pa-GFP的煙草BY-2原生質(zhì)體的單光子透射熒光圖像。(a)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，未激活 (b) pa-GFP的雙光子激活期間 (c–e) 雙光子激活后，所示時(shí)間點(diǎn)。(a)核內(nèi)（紅虛線）的pa-GFP在雙光子激發(fā)前平均熒光很難被檢測(cè)到。使用4個(gè)平行焦點(diǎn)(10mW at 800 nm 每焦點(diǎn))的持續(xù)3s的飛秒激光對(duì)一個(gè)7X8um的區(qū)域進(jìn)行pa-GFP 2光子激發(fā)開(kāi)始 (b) 激發(fā)后很短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到一個(gè)強(qiáng)的熒光信號(hào)(c–e) pa-GFP從核內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)的擴(kuò)散被監(jiān)測(cè)，直到兩組分間達(dá)到平衡。熒光強(qiáng)度標(biāo)尺顯示在每幅圖的左邊。

Fig. 4.在核內(nèi)被光激活后，pa-GFP從核內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)散的量化分析。在激活前，核內(nèi)（ROI）平均的1光子熒光強(qiáng)度非常低（平均強(qiáng)度～300）.在26s和29s間的時(shí)間點(diǎn)，由飛秒激光激活誘導(dǎo)的熒光增強(qiáng)在圖上進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。 與光激活前相比，平均熒光強(qiáng)度是之前的大約5倍，伴隨著ROI內(nèi)的熒光降低。在個(gè)地方，監(jiān)測(cè)到的細(xì)胞核內(nèi)熒光下降是由于激活的pa-GFP向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的擴(kuò)散。后來(lái)，光漂白變得顯著。雙指數(shù)擬合非常近似地?cái)M合了整個(gè)熒光下降過(guò)程（紅線）。以此方式計(jì)算出這個(gè)實(shí)驗(yàn)中175s的擴(kuò)算時(shí)間常數(shù)。

Fig. 5. 煙草BY-2原生質(zhì)體中At2g38360-DsRed的定位和平行雙光子熒光顯微鏡對(duì)pa-GFP的3D監(jiān)測(cè)（64 foci, 920 nm, 240 mW)。 (a) 雙光子熒光下降的量化分析，給出了一個(gè)123s的擴(kuò)散時(shí)間常數(shù)。Figs. 3 and 4中的數(shù)據(jù)源于兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)，解釋了熒光值的絕對(duì)差異（不同的表達(dá)水平）和統(tǒng)計(jì)分析。 (b) At2g38360-DsRed作為轉(zhuǎn)染標(biāo)記在核中pa-GFP激活前的熒光 (c) At2g38360-DsRed和pa-GFP數(shù)據(jù)采集后400 s的3D熒光圖像，清楚顯示了熒光團(tuán)從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的擴(kuò)散。

Fig. 6.在核內(nèi)光激活前后,煙草BY-2原生質(zhì)體內(nèi)活躍轉(zhuǎn)運(yùn)的pa-GFP-LCL1的3D動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和量化分析。(a) 在pa-GFP-LCL1雙光子激發(fā)后核內(nèi)的單光子熒光表明雙光子激活熒光增強(qiáng) (b) pa-GFP被雙光子激活后雙指數(shù)曲線擬合（紅線）的熒光下降量化分析。計(jì)算得出的由于主動(dòng)運(yùn)輸導(dǎo)致的核內(nèi)pa-GFP-LCL1熒光下降的一個(gè)20s的時(shí)間常數(shù)(c,d) At2g38360-DsRed（轉(zhuǎn)染標(biāo)記）和pa-GFP-LCL1的雙色雙光子熒光3D成像 (c)核內(nèi)光激活前 (d)數(shù)據(jù)獲取后

Fig. 7. 煙草BY-2原生質(zhì)體的核輸出陰性突變pa-GFP-LCL1(NESm)光激活前后的3D動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和量化分析。(a) pa-GFP-LCL1(NESm)被雙光子激活后的單光子熒光顯示了雙光子激活熒光增強(qiáng)和激活后核內(nèi)熒光極其緩慢的下降，反映了pa-GFPLCL1(NESm)的核限制 (b,c) At2g38360-DsRed (轉(zhuǎn)染標(biāo)記) 和 pa-GFP-LCL1(NESm) 的雙光子熒光3D圖像 (b) 光激活前的核內(nèi) pa-GFP (c) 數(shù)據(jù)獲取后300s的時(shí)間點(diǎn)