農(nóng)業(yè)部1486號(hào)公告-3-2010

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定飼料中安普霉素的高效液相色譜法，適用于配合飼料。濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料中安普霉素的測(cè)定，方法檢出限和定量限分別為3mg/kg和10mg/kg。

 

飼料中的安普霉素用鹽酸溶液提取，經(jīng)陽離子固相萃取柱凈化后，以領(lǐng)苯二甲醛衍生，然后用高效液相色譜分離和熒光檢測(cè)器檢測(cè)，以外標(biāo)法進(jìn)行定量。

 

除特殊注明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用的試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T 6682二級(jí)用水的規(guī)定。

無水甲醇。

氨水，25%。

濃鹽酸。

鹽酸溶液（c(HCI)=0.10mol/L）：準(zhǔn)確量取8.4ml濃鹽酸，用水稀釋至1000ml。

氨水甲醇溶液：量取20ml甲醇于100Ml容量瓶中，加入5.00ml氨水，然后用甲醇定容至刻度。

氫氧化鈉溶液（c(NaOH)=6mol/L）：240g氫氧化鈉溶解于1000ml水中。

硼酸鹽緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取24.73g硼酸于1000ml燒杯中，用約900ml水溶解，然后用氫氧化鈉溶液調(diào)PH至9.5，并用水定容至刻度。

 

安普霉素白哦準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥99%）0.0250g，至于25ml容量瓶中，用水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，其濃度 為1mg/ml。4℃條件下貯藏，有效期1個(gè)月。

安普霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液10.00ml，置于100ml容量瓶中，用水稀釋、定容，其對(duì)應(yīng)的濃度為100ug/ml。

安普霉素標(biāo)準(zhǔn)工作也：取安普霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液2.50ml、1.25ml、0.500ml、0.250ml和0.125ml分別于25.0ml容量瓶中，用硼酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，其濃度分別為10.0ug/ml、5.00 ug/ml、2.00 ug/ml、1.00 ug/ml和0.500 ug/ml。

流動(dòng)相A：稱取0.77g乙酸銨于1000ml容量瓶中，加水約800ml，待其溶解后，加乙酸40ml，并用水稀釋至刻度，搖勻。

流動(dòng)相B：乙腈，色譜純。

具有反相與陽離子交換雙重保留機(jī)制的混合型固相萃取小柱。

 

分析天平：感量為0.0001g。

磁力攪拌器。

離心機(jī)：能達(dá)3000r/min-4000r/min。

固相萃取裝置。

恒溫水浴鍋。

氮?dú)獯蹈蓛x。

GE-200高效液相色譜儀，Clarify色譜工作站，（Wters 474熒光檢測(cè)器）。

按GB/T 14699.1采取有代表性的樣品1000g，用四分法縮減至約200g，粉碎，使全部通過0.45mm孔徑的篩，婚育，貯存于磨口瓶中備用。

 

稱取適量試樣（配合飼料5g，濃縮飼料2g-3g，添加劑預(yù)混合飼料1g，精確至0.0001g）置于50ml離心管中，加鹽酸溶液40ml，蓋好蓋，置于磁力攪拌器上攪拌提取25min，于離心機(jī)上3000r/min-4000r/min離心10min。上清液轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，再分別用35ml、25ml鹽酸溶液提取2次，匯集上清液，并用鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，用中速定量濾紙過濾，濾液備用。濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料上述濾液需要分別做5倍和10倍稀釋。

分別用1.0ml甲醇，和1.0ml水活化固相萃取小柱，然后準(zhǔn)確加載1.00ml樣品提取液于固相萃取小柱，并以不超狗1.0ml/min的流速過柱，然后分別用1.0ml顏色溶液和1.0ml甲醇各淋洗一次，用氨水甲醇溶液洗脫至10ml試管中，然后置于60℃水浴中，用氮?dú)獯蹈�，�?.00ml硼酸鹽緩沖液溶解后，待上機(jī)測(cè)定。

 

色譜柱：Vertex C18,柱長300mm，內(nèi)徑3.9mm，粒度5um分析柱。

柱溫：室溫。

流動(dòng)相：流動(dòng)相A——流動(dòng)相B=1+1（v/v），流速1.0ml/min，洗脫時(shí)間15min。

檢測(cè)器：激發(fā)波長230nm，發(fā)射波長389nm

進(jìn)樣量：100ul。

準(zhǔn)確移取樣品溶液400ul置于高效液相色譜儀的進(jìn)樣瓶中，加入200ul的衍生試劑混合，控制衍生時(shí)間5.0min,立即進(jìn)樣，進(jìn)行分離測(cè)定。

準(zhǔn)確移取安普霉素標(biāo)準(zhǔn)工作也400ul，進(jìn)行衍生、測(cè)定，并以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度對(duì)峰面積繪制工作曲線。

試樣中安普霉素的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/kg）表示，X=n*V*p/m

X---試樣中安普霉素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）

V---制備最終用試樣溶液的體積，單位為毫升（ml）

m---試樣質(zhì)量，單位為克（g）

p---由工作曲線計(jì)算得出的上機(jī)試樣溶液中安普霉素濃度，單位為微克每毫升（ug/ml）

n---稀釋倍數(shù)

測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

允許差：同一實(shí)驗(yàn)室同一操作人員完成的2個(gè)平行測(cè)定的相對(duì)偏差不小于15%。

 

本標(biāo)準(zhǔn)遵照GB/T 1.1-2009

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人名共和國農(nóng)業(yè)部畜牧業(yè)司提出

起草單位：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心

起草人：張麗英、林東下、王宗義、唱碧影、楊文君、賀平麗。