本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗人 Foxp3 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 Foxp3與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人Foxp3，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，F(xiàn)oxp3濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中Foxp3濃度。

1.          收集標本：血清、血漿（EDTA）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿、尿液等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。

2.          標準品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成4000pg/ml的溶液。設(shè)標準管8管，每管加入標本稀釋液200ul。在第一管中加入4000pg/ml的標準品溶液200ul混勻后用加樣器吸出200ul，移至第二管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第七管中吸出200ul棄去。第八管為空白對照。

3.          10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4.         洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

             1.   將450ul標本稀釋液加入到一支1.5ml進口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標本。

 2.   加20ul 1 N HCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60± 2分鐘。

     3.   加20ul 1 N NaOH,蓋緊，上下混勻。

     4.   即用，或放-20/-70℃保存3天。計算結(jié)果時乘以稀釋倍數(shù)50。（注意：不同的標本Foxp3的水平可能有較大差異，請根據(jù)實際情況靈活掌握稀釋度）

     5.   細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿10倍稀釋(410ul的標本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。

1.          加樣：每孔各加入標準品或待測樣品（已激活）100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。

2.          洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。

3.          每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。

4.          洗板：同前。

5.          每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。

6.          洗板：同前。

7.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。

8.          每孔加入100ul終止液混勻。

9.          30分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值。

1.          所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。

2.          以標準品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。

3.          根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)Foxp3含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。

             1.   靈敏度：最小的Foxp3 檢測濃度小于16pg/ml。

2.        特異性：可同時檢測重組或天然的人Foxp3。不與人其它細胞因子有交叉反應(yīng)。

3.        重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于10％。

             1.   以上標準孔及待測樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時做標準曲線。

 2.   洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及OD值錯誤地升高。

             3.   板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

             4.   本試劑盒宜置4^oC冰箱保存。

 5.   本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！