利用沃特世 UPLC-Xevo TQ 系統(tǒng)一次性檢測(cè)奶粉中 13 種激素類物質(zhì)

王冰，袁漢成，王少珍，耿霞
沃特世科技（上海）有限公司

2010 年 7 月，一則 “ 乳制品致嬰兒性早熟 ” 的新聞報(bào)道引起了社會(huì)廣泛的關(guān)注。這是至 08 年 “ 三鹿奶粉 ” 事件之后，又一起有關(guān)乳制品食品安全事件。事件一出，農(nóng)業(yè)部立即出臺(tái)檢測(cè)方法，對(duì)相關(guān)奶粉中的激素進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為：該乳品中激素含量水平均在國(guó)家限定范圍內(nèi)。此次事件中人們對(duì)嬰兒食用奶粉中的雌激素和孕激素水平是否超標(biāo)的問題引起了廣泛的討論，同時(shí)對(duì)激素類物質(zhì)檢測(cè)的相關(guān)指標(biāo)提出了更高的要求。曾有專家指出目前在我國(guó)還沒有專門針對(duì)奶粉中激素檢測(cè)的專門的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，所采用的是動(dòng)物性食品中激素檢測(cè)方法。針對(duì)這一問題，沃特世最新推出了 UPLC ® -Xevo TM TQ 質(zhì)譜系統(tǒng)，專門針對(duì)奶粉中雌激素和孕激素物質(zhì)進(jìn)行快速檢測(cè)與定量分析。

沃特世 UPLC-Xevo TQ 系統(tǒng)對(duì)奶粉中性激素快速檢測(cè)的原理

首先利用 UPLC （超高效液相色譜）的超高效分離能力實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢測(cè)的奶粉的有效分離，并采用 Xevo TQ 的 IntelliStart TM 功能快速方便建立質(zhì)譜， PICS （子離子確認(rèn)掃描）功能輔助定性，以及應(yīng)用 Quanpedia （方法庫(kù)）自動(dòng)導(dǎo)入和導(dǎo)出生成 MRM 方法及液相方法，最后通過利用 UPLC/Xevo TQ 的正負(fù)電離模式快速切換功能 , 實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣，同時(shí)檢測(cè)多種激素（ 7 種雌激素， 6 種孕激素），明顯縮短檢測(cè)周期 , 提高檢測(cè)通量。

分析條件與步驟

本試驗(yàn)適用于分析外源性激素類物質(zhì)，如果分析內(nèi)源性物質(zhì)可對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行酶解，酶解后的處理方法相同。

樣品前處理

•  精確稱取 1g 奶粉樣品于 8ml 水中，充分混勻，超聲 5min
•  在混勻液中加入 1ml 冰醋酸，酸化后再添加 16ml 乙腈進(jìn)一步沉淀水溶性蛋白。 7500rpm 離心 10min ，取上清液于氮?dú)饬飨麓抵烈译婧��?<5%
•  分別用 6ml 甲醇、 6ml 水活化平衡 Oasis HLB （ 200mg/6cc ） 小柱
•  上樣，流速控制在 3-4ml/min
•  清洗：分別用 6ml 酸洗（ 5% 甲醇、 2% 冰醋酸）、 6ml 堿洗（ 5% 甲醇、 2% 氨水）、 6ml 甲醇水溶液（ 10% 甲醇）進(jìn)行清洗
•  將清洗后的 Oasis HLB 小柱抽干 10min
•  乙酸乙酯 / 甲醇（ 9/1 v/v ）活化氨基小柱（ Sep-pak NH2 500mg/6cc ），活化平衡后與 Oasis HLB 柱串聯(lián)
•  洗脫 : 分別用 6ml 乙酸乙酯 / 甲醇（ 9/1 v/v ）、 6ml5% 氨水甲醇溶液洗脫串聯(lián)后的兩根柱子，收集洗脫液
•  氮?dú)饬飨麓蹈上疵撘褐?0.2ml
•  依次加入 0.4ml 乙腈、 0.4ml 水溶液，分別渦旋，使最終體積為 1ml ，其中乙腈與水的比例為 1:1
•  7000rpm 離心 10min 或過膜，收集上清液于 UPLC/MS/MS 分析

LC 條件

LC 系統(tǒng)： ACQUITY UPLC ® 系統(tǒng)
色譜柱： ACQUITY UPLC HSS T3 ， 2.1 × 50mm ， 1.8µm
柱溫： 40 ℃
樣品室溫度： 10 ℃
流速： 0.6mL/min
流動(dòng)相 A ： 乙腈
流動(dòng)相 B ：水

梯度：

弱洗針溶液： 10% 乙腈水溶液
強(qiáng)洗針溶液： 90% 乙腈水溶
總運(yùn)行時(shí)間： 6min
進(jìn)樣體積： 5µL ，不充滿定量環(huán)（針溢出）

MS 條件

MS 系統(tǒng)： Xevo TQ MS
電離模式： ESI+/ESI
­ 噴霧電壓： 3.2kv （ ESI+ ） /2.8kv （ ESI- ）
脫溶劑氣：氮?dú)猓?1000L /Hr ， 450 ℃
錐孔氣：氮?dú)猓?50L /Hr
源溫度： 150 ℃
采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（ MRM ） 其他質(zhì)譜參數(shù)：

數(shù)據(jù)采集與處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為 Waters® MassLynxTM 4.1 SCN729 ，質(zhì)譜方法開發(fā)用此軟件的 IntelliStart 功能，不需要有經(jīng)驗(yàn)的質(zhì)譜操作人員進(jìn)行方法開發(fā)與優(yōu)化，同時(shí)配合 TargetLynx® 軟件，只需設(shè)置幾個(gè)參數(shù)即可得到完整的報(bào)告。 IntelliStart 功能可同時(shí)開發(fā)正負(fù)離子質(zhì)譜參數(shù)，并實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣正負(fù)離子同時(shí)掃描，如圖 1 ，圖 2 所示。

圖 1

圖 2

圖 2 13 種激素類物質(zhì)提取離子色譜圖

圖 3 奶粉基質(zhì)中 8 種激素類物質(zhì)提取離子色譜圖

結(jié)果與討論

圖 2 和圖 3 分別為 13 種激素類物質(zhì)提取離子色譜圖和奶粉基質(zhì)中 8 種激素類物質(zhì)提取離子色譜圖。

通過使用 UPLC/Xevo TQ MS 對(duì) 13 種激素類物質(zhì)進(jìn)行分析， 6min 時(shí)間即可得到分析結(jié)果，同時(shí)在靈敏度和分離度等方面都能得到滿意的結(jié)果。沃特世 ACQUITY UPLC 系統(tǒng)高效的分離度使質(zhì)譜在多物質(zhì)采集過程中對(duì)每一種物質(zhì)都有足夠的駐留時(shí)間進(jìn)行分析，提高靈敏度的同時(shí)增加 10 了定性的可靠性。 Xevo TQ MS 快速的正負(fù)離子切換功能使得實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣，同時(shí)檢測(cè)多種激素（ 7 種雌激素， 6 種孕激素），明顯縮短檢測(cè)周期，提高檢測(cè)通量。

Xevo TQ 系統(tǒng)應(yīng)用 MassLynx 4.1 的 IntelliStart 功能，可自動(dòng)、方便、快速的進(jìn)行樣品質(zhì)譜條件的自動(dòng)優(yōu)化。本試驗(yàn)質(zhì)譜方法開發(fā)全部使用了 IntelliStart 功能自動(dòng)優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果均能令人滿意。同時(shí)因該系統(tǒng)不需要有經(jīng)驗(yàn)的質(zhì)譜操作人員進(jìn)行方法開發(fā)與優(yōu)化，所以很大程度上節(jié)省了人力和物力。