ACQUITY UPLC -ELSD 測定奶粉和牛奶中八種糖的含量
趙淑軍 沃特世公司，上海 ，中國

關(guān)鍵詞：

超高效液相色譜 奶粉 牛奶 Fructose( 果糖 )Sorbose （山梨糖 )
Glucose( 葡萄糖 )Sucro se( 蔗糖 )Malto se( 麥芽糖 )Lacto se( 乳糖 )
Maltotriose( 麥芽三糖 ) Maltotetraose( 麥芽四糖 )

實驗方法

材料、試劑和儀器

乙腈為色譜純，三乙胺為優(yōu)級純，實驗用水為超純水
(18MΩ,TOC3ppb) ， ACQUITY UPLC 超高效液相色譜系統(tǒng)，Acquity ®
ELSD 檢測器 ,(FILTER MIXER (425μl,P/N 205000403), 可不用 ) 。

色譜條件

液相系統(tǒng)：Waters ACQUITY UPLC ®
配 ACQUITY ELSD 蒸發(fā)光散射檢測器
色譜柱： AACQUITY UPLC BEH Amide 2.1mm x 100mm ，1.7 μm, P/N:1860 04801

柱溫：35˚C
分析時間：18min
進(jìn)樣量： 5ul( 樣品進(jìn)樣 2ul)
流動相： A: 水 B:0.2%TEA 乙腈溶液 ; 梯度 洗脫
弱洗溶劑： 乙腈 / 水 =90 /10 ， 8 00µl
強(qiáng)洗溶劑： 乙腈 / 水 =10/9 0 ， 500 µl
進(jìn)樣方式： 不充滿定量環(huán)（使用針溢出）

ELSD 條件：
增益： 5 00
數(shù)據(jù)率： 10pp s
噴霧器模式： 冷卻
漂移管溫度： 55˚C
氣體壓力： 30 psi
實驗室試驗溫度： 20˚ C
實驗室試驗濕度： 45%
工作電源： 220V 穩(wěn)定電源

梯度方法見下表：

數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

Empower 2

前處理方法

稱取 2. 0 g 奶粉樣品或 5ml 液態(tài)奶樣品，加入20mL( 對于液態(tài)奶添加 15ml)1/1 的乙腈水溶液溶解，手搖震蕩混勻，然后渦旋混勻 2 分鐘，室溫下 8000 r/min 離心 15 分鐘，取上清液過0 .2µm濾膜；對于某些樣品由于糖含量很高，所以過濾后的樣品可能需要用乙腈 / 水 =7 0/3 0 的溶液稀釋一定倍數(shù)后，進(jìn)樣檢測。

結(jié)果與討論

標(biāo)準(zhǔn)配制

八種糖標(biāo)準(zhǔn)分別稱取 10 mg ，用 1/1 的乙腈水定容至 1ml ，然后用乙腈 / 水 =70/3 0 的溶液稀釋配制各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實驗。

八種糖 UPLC 分離檢測色譜圖及數(shù)據(jù)

圖 1. 八種糖 UPLC 分離檢測色譜圖

圖 1 是八種糖 50ppm 混合標(biāo)準(zhǔn)品用 UPLC(ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱) 分離， E LSD 檢測的色譜圖，按照保留時間順序分別是： Fructo se( 果糖 ) 、 Sorbose( 山梨糖 ) 、 Glucose( 葡萄糖 ) 、 Sucrose( 蔗糖 ) 、 Malto se( 麥芽糖 ) 、 Lacto se( 乳糖 ) 、 Maltotriose( 麥芽三糖 ) 、 Maltotetraose( 麥芽四糖 ) ；包括 5 種單糖和 3 種多糖。有關(guān)數(shù)據(jù)見下表。

表 2. 八種糖 標(biāo)準(zhǔn)品分離分析數(shù)據(jù)

其中較難分離的 Fructose( 果糖 ) 和 So rbose( 山梨糖 ) 、 Maltose( 麥芽糖 ) 和 Lacto se( 乳糖 ) 均分別達(dá)到 1.6 、 1.5 的分離度。

方法的檢出限

如圖 2 所示，為 5pp m 的混標(biāo)色譜圖，此濃度下按保留時間順序八種糖的信噪比分別達(dá)到 3 、 5 、 5 、 24 、 6 、 12 、 5 和 3 ， ( 進(jìn)樣量 10ul ）：

圖 2. 5ppm 的混 標(biāo)色譜圖

可見，八種 糖中 Fructose( 果 糖 ) 、 Sorbose( 山梨 糖 ) 、 Glucose( 葡萄糖 ) 、 Maltose( 麥 芽糖 ) 、 Maltotriose( 麥芽三糖 ) 和 Maltotetraose
( 麥芽四 糖 ) 的檢 測限 為 5ppm ；此 濃度 下 Lacto se( 乳糖 ) 可達(dá)到定量限，而 Sucrose( 蔗糖 ) 的定量限可以到達(dá) 2ppm 。

方法的線性相關(guān)性

濃度分別為 5.0 00 、 10.000 、 20.000 、 50.000 、 10 0.000 、 150.000mg/L 的八種 糖標(biāo)準(zhǔn)品依 次進(jìn)樣，進(jìn)樣量均為 5µ L ，外標(biāo)法定量。以峰面積 A 的 lg 值 為縱坐標(biāo)，濃度 C 的 lg 值為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到 8 種糖的線性方程、復(fù)相關(guān)系數(shù)和線性曲線圖如圖 3- 圖 10 所示，在 5.000-150.000 mg/L 范圍 8 種糖均具有良好的 lg-lg 線性關(guān)系。

圖 3(左). Fructose 工作曲線和方程
圖 4（右）. Sorbose 工作曲線和方程

圖 5（左）. Glucose 工作 曲線和方程
圖 6（右）. Sucrose 工作曲線和 方程

實際樣品檢測結(jié)果

從市場取某一奶粉樣品，進(jìn)行實際提 取實 驗，進(jìn)樣檢測，色譜圖及結(jié)果數(shù)據(jù)見圖 11 所示，可以看出此樣品中含有蔗糖、 乳糖、麥芽三糖和麥芽四糖四種糖成分，同時發(fā)現(xiàn)蔗糖和乳糖的含量相當(dāng)高，已經(jīng) 超出檢測器的響應(yīng)范圍；因此將此樣品稀釋 100 倍后再次進(jìn)樣檢測，結(jié)果數(shù)據(jù)見圖 12 。

圖 11. 奶 粉提取 樣品色譜圖及結(jié) 果數(shù)據(jù)由圖 11 和 12 的數(shù)據(jù)可以知道此奶粉中含有蔗糖 16.8mg/g 、乳糖140.1 mg/g 、麥芽三糖和麥芽四糖的含量分別只有 1.9 mg/g 、 1.3 mg/g 。某液態(tài)奶提取后，稀釋 100 倍檢測結(jié)果見圖 13 。

圖 13. 液態(tài)奶提 取樣品稀釋 100 倍色譜圖及結(jié)果數(shù)據(jù)

重現(xiàn)性

首先用 50 ppm 混合標(biāo)準(zhǔn) 6 次連 續(xù)重復(fù)進(jìn)樣，考察標(biāo)準(zhǔn)品 在本方法下的穩(wěn)定性，見圖 14 所示重疊色譜圖，重復(fù)數(shù)據(jù)見表 3 、表 4 。

圖 11. 50ppm 標(biāo)準(zhǔn)品 6 次連續(xù)進(jìn)樣重疊色譜圖

表 3. 8 種分析物標(biāo)準(zhǔn) 6 次連續(xù)進(jìn)樣保留時間重現(xiàn)性表

提取奶粉實際樣品，由于乳糖含量較高，將其稀釋了 100 倍，然后在不同天次連續(xù) 3 天進(jìn)樣檢測，考察本方法對于實際樣品日間的重現(xiàn)性情況，如圖 15 所示是該實際樣品 3 天內(nèi) 3 次進(jìn)樣的重疊色譜圖，由圖可見該方法對實際樣品在日間具有較好的重現(xiàn)性。

圖 15. 實際奶 粉提取樣 品日間重疊色譜圖

結(jié)論

本方法建立了用 Waters UP LC-ELSD 系統(tǒng)檢測奶粉和牛奶實際樣品中 Fructose( 果糖 ) 、 Sorbose( 山梨糖 ) 、 Glucose( 葡萄糖 ) 、 Sucrose( 蔗糖 ) 、 Malto se( 麥芽糖 ) 、 Lacto se( 乳糖 ) 、 Maltotriose( 麥 芽三糖 ) 、 Maltotetrao se( 麥芽四糖 )8 種常見糖的的定量分析方法。

方法的檢出限 : 有 6 種糖達(dá)到 5μg/g ，另外兩種糖 Sucrose 和 Lactose 在 5μg/g 下的信噪比可達(dá)到 24 和 12 。使用 ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱和三乙胺流動相體系， 8 種糖均實現(xiàn)基線分離，可以用于奶粉和牛奶中常見這 8 種糖的含量測定。

參考文獻(xiàn)：

Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Columns Care & Use ， P/N:715001371