COLD-PCR和高分辨率溶解結(jié)合使用，高效的篩查和鑒定癌癥基因低水平的未知突變

研究背景：

癌癥中體細(xì)胞分子層面的突變，常常需要在大量野生型DNA中辨識(shí)低濃度的DNA突變。但是，突變檢測(cè)方法的選擇率和靈敏度常常限制了鑒定低濃度突變的可靠性。最近開發(fā)的COLD-PCR（低變性溫度下的復(fù)合擴(kuò)增，李等人。2008）解決了低含量基因突變檢測(cè)的一些局限性，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中利用關(guān)鍵變性溫度豐富含有突變的擴(kuò)增子，不論突變位于序列的什么地方。COLD-PCR的一個(gè)主要屬性是富集突變體以便于在PCR后的直接測(cè)序。然而堿基測(cè)序仍然是昂貴的選擇，從而通過(guò)高通量掃描序列預(yù)檢是有吸引力的辦法。高分辨率融解（HRM）是一種可用于預(yù)篩查測(cè)序之前未知突變的技術(shù)，但不能確定具體的檢測(cè)基因突變的身份。因此，為了富集、快速篩查和鑒定低濃度的未知突變，我們把HRM突變掃描和COLD-PCR相結(jié)合，隨后進(jìn)行已知突變的直接測(cè)序鑒定。

方法：

一系列稀釋的HCC2157細(xì)胞系和SW480 (ATCC)細(xì)胞雄株基因組DNA準(zhǔn)備用于評(píng)估方法的靈敏度。
TP53基因的外顯子7和8通過(guò)常規(guī)PCR和COLD-PCR進(jìn)行擴(kuò)增。COLD-PCR使用較低的變性溫度（低于擴(kuò)增變性溫度~1℃）來(lái)優(yōu)先擴(kuò)增在序列上含有突變的DNA。使用Cepheid SmartCycler II PCR儀。
對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中存在的突變隨后通過(guò)HRM在LightScanner HR96 (Idaho Technologies Inc.)上進(jìn)行篩選
擴(kuò)增產(chǎn)物在美國(guó)Dana - Farber研究所分子生物學(xué)的核心機(jī)構(gòu)進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證突變的位點(diǎn)和類型。
這種方法使用人類肺腺癌手術(shù)的DNA樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。

系列稀釋為檢測(cè)HRM靈敏度

常規(guī)PCR擴(kuò)增子的HRM分析，具有一個(gè)突變檢測(cè)極限，4.0%到10.0%（外顯子7）。(圖1A)

COLD-PCR擴(kuò)增子的HRM分析，具有一個(gè)突變檢測(cè)極限，0.25%到1.0%（外顯子7）。(圖1B)

這證明通過(guò)COLD-PCR-HRM方法進(jìn)行檢測(cè),比常規(guī)PCR-HRM法靈敏度提高了10-20倍
TP53基因外顯子7比外顯子8的擴(kuò)增效率低,這是由于兩者存在不同的熔化區(qū)域.(數(shù)據(jù)沒(méi)列出)

肺腫瘤的HRM分析
TP53基因第7外顯子，常規(guī)PCRP-HRM和COLD-PCR-HRM兩種方法都發(fā)現(xiàn)所有7種已知突變，（圖2）兩種方法均有野生對(duì)照組。

TP53基因第8外顯子，常規(guī)PCR-HRM可靠地檢測(cè)出6個(gè)低含量的突變，但3個(gè)得分為“未知”，這表明可能存在突變。
COLD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的HRM分析確認(rèn)了所有的9種低含量的突變，（圖3）包括通過(guò)常規(guī)PCRHRM分類為“未知”的三種突變。

序列分析：

這里評(píng)價(jià)的16個(gè)突變，半數(shù)無(wú)法通過(guò)常規(guī)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物可靠地測(cè)序確定
COLD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析準(zhǔn)確定義外顯子7里94%的突變和100%的外顯子8突變。代表測(cè)序圖見圖4。

盡管通過(guò)COLD-PCR對(duì)突變進(jìn)行富集，一個(gè)突變（樣本TL78）不能通過(guò)測(cè)序來(lái)鑒定，可能是目前是TP53基因外顯子7的擴(kuò)增產(chǎn)物中突變檢測(cè)的底限。我們推測(cè)TL78的突變?cè)谝吧�等位基因間的小于1%。