用 CsCl，Percoll, Nycodenz, metrizamide作自形成密度梯度離心
近年來用重金屬鹽（主要是 CsCl）分離生物大分子的平衡等密度離心；用 Percoll（由瑞典 pharmacia-Biosystems AB開發(fā)的膠體硅材料，即在硅顆粒外包覆 PVP塑料、直徑在 15nm～20nm以下的膠狀小顆粒）自形成梯度分離細胞和亞細胞構(gòu)造；用 Nycodenz和 metrizamide（由挪威的 Nycomed pharma A/S開發(fā)的碘化物梯度材料）的自形成梯度分離整細胞、亞細胞構(gòu)造、核蛋白、病毒等方面的研究工作有令人滿意的進展【參考文獻（1）】，開發(fā)商也提供了很多技術(shù)資料、配制了很多實用的標準液用于梯度制備。
二）自形成梯度離心分離的優(yōu)點：
不需要預(yù)先制備梯度，簡化了離心工藝。
用于制備自形成梯度的材料化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對被分離物質(zhì)無損害。
無毒性。
某些材料（如 Percoll，Nycodenz）在高速（RCFav＝20,000×g～30,000×g）短時間（10
分～60分）就能自形成較緩和的或較陡的復(fù)合（由凸指數(shù)過渡到凹指數(shù)）梯度曲線，用于不用樣品的分離純化。
開發(fā)商提供了部分由梯度材料和稀釋液配置的各種密度的等滲液，方便了用戶配置。
可與樣品混合直接做自形成密度梯度實驗（如生物大分子的 CsCl平衡等密度離心），也可以預(yù)先離心制備自形成梯度后在梯度表面鋪置樣品再進行密度梯度離心。
可以用各種轉(zhuǎn)頭（固定角式、甩平、近垂直、垂直管、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭）制備自形成梯度，被分離樣品的容量范圍很寬。
由于近年來利用自形成密度梯度離心的論文增多，用戶可以根據(jù)需要找到相應(yīng)的參考資料（文獻3）。
自形成梯度材料的擴散很慢，一旦形成梯度，梯度曲線變化很小。同樣，沉降在其等密度區(qū)的樣品擴散也很小（等密度離心）。對于利用梯度材料預(yù)先離心制備的自形成梯度作速率－區(qū)帶離心（Rate-zonal）,樣品的沉降速度變化穩(wěn)定，重復(fù)試驗的成功率高。某些材料（如 Percoll）一旦形成密度離心梯度后其梯度曲線靜置數(shù)周后變化仍很小。
三）重金屬鹽類自形成梯度有關(guān)計算公式（參考文獻 4） 
注意公式中 r1：離心管表面（彎月面）到旋轉(zhuǎn)中心距離（cm）
r2：離心管底到旋轉(zhuǎn)中心距離（cm）
ρ1：離心管表面液體密度(g/cm3)
ρ2：離心管底部液體密度(g/cm3)
ρi：初始密度(g/cm3)
β0：參考講座文獻（10）
N：rpm
需要說明的是以上計算的離心時間是理論上的達到完全平衡的時間，對于單管容量為 12ml的角式轉(zhuǎn)頭，達到離心所需要的近似平衡的時間比理論計算值要短。上面的計算式結(jié)合實際實驗需要的計算機模擬已在 80年代末至 90年代初實現(xiàn)了，最新的日立或貝克曼的超速離心機都具有這種模擬功能，有一些型號還可以與 PC機聯(lián)機運算。
用重金屬鹽的自形成梯度分離純化生物大分子從 80年代起已普遍被應(yīng)用，為了減少用甩平或角式轉(zhuǎn)頭作自形成梯度離心的時間，也為了避免垂直管轉(zhuǎn)頭【（r2-r1）最小，離心時間最短】在離心管外壁會形成 RNA沉淀從而在梯度轉(zhuǎn)換過程中會降低蛋白質(zhì)，染色體，DNA片斷和質(zhì)粒 DNA的純度，在80年代末開發(fā)了小角度（8°～10°，近垂直）轉(zhuǎn)頭，主要用于這類實驗。
必須提醒的是模擬功能中有避免重金屬鹽在極大離心力和低溫下結(jié)晶的警告，使用一般無模擬功能離心機的實驗人員要注意最高轉(zhuǎn)速和允許最低溫度的限制（一般用 18℃～20℃）。離心過程中產(chǎn)生結(jié)晶是非常危險的，固態(tài)結(jié)晶硬度很高，在強離心場中會刺穿管壁并繼續(xù)向外穿刺轉(zhuǎn)頭孔外壁，造成漏液和轉(zhuǎn)頭受損。避免的方法首先是合適的離心溫度，其次是最高轉(zhuǎn)速限制。為了既滿足了轉(zhuǎn)速限制又能減少分離時間，用逐級降速的分步（step）離心是有效的方法（分4～5級，逐級降速），而目前生產(chǎn)的超速離心機，除某些經(jīng)濟型外都有這種分步離心功能。
用微量超速離心機在較小的容量時利用極高離心力和分步離心可以在 2～4小時內(nèi)分離純化生物大分子的各種組份。
自形成密度梯度在高轉(zhuǎn)速時非常穩(wěn)定，在減速時梯度會發(fā)生轉(zhuǎn)換，由于自形成梯度材料的粘度很低，梯度轉(zhuǎn)換時容易產(chǎn)生不同密度層之間的混合，因此必須利用離心機在降到 1,000rpm以下時的慢減速功能，為了實現(xiàn)各種實驗的最佳梯度方向轉(zhuǎn)換，離心機 1,000rpm→0的減速分級應(yīng)在5檔以上。
此外，如果利用梯度材料在離心過程中自形成梯度后再在液面鋪樣品作速率－區(qū)帶或等密度離心，鋪樣時要注意不使樣品沖入梯度層。傾斜貼壁慢加樣可以避免這一點。當樣品中有較大顆粒成分時更要特別小心。
四）碘鹽自形成梯度：（ Nycodenz或 metrizamide）
這二種梯度材料在固定角式轉(zhuǎn)頭或垂直管轉(zhuǎn)頭，近垂直轉(zhuǎn)頭離心過程中會用較短的時間就可以自形成密度。
和重金屬鹽一樣，離心力、轉(zhuǎn)頭種類、離心時間對自形成梯度的形狀都有很大的影響。
由于碘鹽的粘性系數(shù)對溫度很敏感，很小的溫升也會因粘性降低而加速自形成梯度的形成。
碘鹽的擴散速度比重金屬鹽要快一些，為了修正梯度曲線，一般在離心管底部鋪較高密度材料（參考文獻 2）
可惜，碘鹽的自形成梯度離心沒有進行數(shù)學(xué)計算式的研究，但是大量的實驗文獻提供了足夠的經(jīng)驗，使我們根據(jù)需分離樣品的特點選擇最佳的梯度形狀（文獻 2，以及 Rickwood.D.有關(guān)這方面一系列的文章）
各種生物體組分在碘鹽中的浮密度
|
|
細胞核 |
線粒體 |
溶酶體 |
過氧化酶體 |
質(zhì)膜 |
天然 DNA |
降解 DNA |
|
Nycodenz |
1.23 |
1.17 |
1.15 |
1.22 |
1.11～1.19 |
1.13 |
1.17 |
|
metrizamide |
1.22 |
1.16 |
1.13 |
1.22 |
1.14～1.26 |
1.12 |
1.14 |
|
RNA |
蛋白質(zhì) |
染色體 |
過氧化物酶 |
mRNA | |
|
Nycodenz |
1.18 |
1.27 |
1.18 |
1.32 |
1.2 |
|
metrizamide |
1.17 |
1.26 |
1.19 |
1.32 |
1.2 |
表（1）用 NaCl稀釋的 Nycodenz等滲液性質(zhì)
濃度計算％W/V＝628.7×RI（折射率）－839
密度計算 g/ml＝3.348×RI－3.466
|
濃度 |
RI |
密度 g/ml |
濃度 |
RI |
密度 g/ml | ||
|
百分比濃度％（W/V） |
Molar |
百分比濃度％（W/V） |
Molar | ||||
|
0.0 |
0.0000 |
1.3361 |
1.0030 |
14.0 |
0.1705 |
1.3568 |
1.0776 |
|
1.0 |
0.0122 |
1.3377 |
1.0083 |
15.0 |
0.1827 |
1.3584 |
1.0829 |
|
2.0 |
0.0244 |
1.3393 |
1.0137 |
16.0 |
0.1949 |
1.3599 |
1.0882 |
|
3.0 |
0.0365 |
1.3409 |
1.0190 |
17.0 |
0.2071 |
1.3615 |
1.0935 |
|
4.0 |
0.0487 |
1.3425 |
1.0243 |
18.0 |
0.2192 |
1.3631 |
1.0989 |
|
5.0 |
0.0609 |
1.3440 |
1.0296 |
19.0 |
0.2314 |
1.3647 |
1.1042 |
|
6.0 |
0.0731 |
1.3456 |
1.0350 |
20.0 |
0.2436 |
1.3663 |
1.1095 |
|
7.0 |
0.0853 |
1.3472 |
1.0403 |
21.0 |
0.2558 |
1.3679 |
1.1148 |
|
8.0 |
0.0974 |
1.3488 |
1.0456 |
22.0 |
0.2680 |
1.3695 |
1.1202 |
|
9.0 |
0.1096 |
1.3504 |
1.0509 |
23.0 |
0.2801 |
1.3711 |
1.1255 |
|
10.0 |
0.1218 |
1.3504 |
1.0563 |
24.0 |
0.2923 |
1.3727 |
1.1308 |
|
11.0 |
0.1340 |
1.3520 |
1.0616 |
25.0 |
0.3045 |
1.3743 |
1.1362 |
|
12.0 |
0.1462 |
1.3536 |
1.0669 |
26.0 |
0.3167 |
1.3759 |
1.1415 |
|
13.0 |
0.1583 |
1.3552 |
1.0722 |
27.0 |
0.3289 |
1.3774 |
1.1468 |
表（2）用葡萄糖稀釋的 Nycodenz等滲液性質(zhì)
濃度計算％W/V＝823.9×RI－1108
密度計算 g/ml＝4.060×RI－4.446
|
濃度 |
RI |
密度 g/ml |
濃度 |
RI |
密度 g/ml | ||
|
百分比濃度％（W/V） |
Molar |
百分比濃度％（W/V） |
Molar | ||||
|
0.0 |
0.0000 |
1.3449 |
1.0140 |
14.0 |
0.1705 |
1.3619 |
1.0830 |
|
1.0 |
0.0122 |
1.3461 |
1.0189 |
15.0 |
0.1827 |
1.3631 |
1.0879 |
|
2.0 |
0.0244 |
1.3473 |
1.0239 |
16.0 |
0.1949 |
1.3643 |
1.0928 |
|
3.0 |
0.0365 |
1.3485 |
1.0288 |
17.0 |
0.2071 |
1.3655 |
1.0978 |
|
4.0 |
0.0487 |
1.3498 |
1.0337 |
18.0 |
0.2192 |
1.3667 |
1.1027 |
|
5.0 |
0.0609 |
1.3510 |
1.0386 |
19.0 |
0.2314 |
1.3680 |
1.1076 |
|
6.0 |
0.0731 |
1.3522 |
1.0436 |
20.0 |
0.2436 |
1.3692 |
1.1126 |
|
7.0 |
0.0853 |
1.3534 |
1.0485 |
21.0 |
0.2558 |
1.3704 |
1.1175 |
|
8.0 |
0.0974 |
1.3546 |
1.0534 |
22.0 |
0.2680 |
1.3716 |
1.1224 |
|
9.0 |
0.1096 |
1.3558 |
1.0583 |
23.0 |
0.2801 |
1.3728 |
1.1273 |
|
10.0 |
0.1218 |
1.3570 |
1.0633 |
24.0 |
0.2923 |
1.3740 |
1.1323 |
|
11.0 |
0.1340 |
1.3583 |
1.0682 |
25.0 |
0.3045 |
1.3752 |
1.1372 |
|
12.0 |
0.1462 |
1.3595 |
1.0731 |
26.0 |
0.3167 |
1.3765 |
1.1421 |
|
13.0 |
0.1583 |
1.3607 |
1.0781 |
27.0 |
0.3289 |
1.3777 |
1.1470 |
表（三）metrizamide及其溶液的性質(zhì)（20℃）
|
濃度 |
密度g/ml |
折射率 |
粘性 |
滲透率 | |
|
百分比濃度％ （W/V） |
Molar | ||||
|
0 |
0.000 |
0.9982 |
1.3330 |
1.0 |
0 |
|
10 |
0.127 |
1.0512 |
1.3483 |
1.3 |
107 |
|
20 |
0.253 |
1.1062 |
1.3646 |
1.6 |
180 |
|
30 |
0.380 |
1.1612 |
1.3809 |
2.3 |
247 |
|
40 |
0.507 |
1.2162 |
13971 |
3.6 |
320 |
|
50 |
0.633 |
1.2712 |
1.4133 |
6.0 |
385 |
|
60 |
0.760 |
1.3262 |
1.4295 |
11.0 |
440 |
|
70 |
0.887 |
1.3812 |
1.4456 |
26.0 |
- |
表（四）Nycodenz及其溶液的性質(zhì)（20℃）
|
濃度 |
密度g/ml |
折射率 |
粘性 |
滲透率 | |
|
百分比濃度％ （W/V） |
Molar | ||||
|
0 |
0.000 |
0.999 |
1.3330 |
1.0 |
0 |
|
10 |
0.122 |
1.052 |
1.3494 |
1.3 |
112 |
|
20 |
0.244 |
1.105 |
1.3659 |
1.4 |
221 |
|
30 |
0.365 |
1.159 |
1.3824 |
1.8 |
299 |
|
40 |
0.487 |
1.212 |
13988 |
3.2 |
388 |
|
50 |
0.609 |
1.265 |
1.4153 |
5.3 |
485 |
|
60 |
0.731 |
1.319 |
1.4318 |
9.5 |
595 |
|
70 |
0.853 |
1.372 |
1.4482 |
17.2 |
1045 |
五）膠體硅（Percoll）自形成梯度
Percoll的性狀（參考文獻 5）
成份：硅顆粒外包覆 PVP（聚乙烯基吡咯烷酮）
密度：1.130±0.005g/ml
顆粒尺寸：15～20nm
滲透率：＜25mosm
粘性：20℃時 10±5mpa•s
PH：20℃時 9.0±0.5
折射率：20℃時 1.3540±0.005
其他：有少量（1～2％）PVP小顆粒存在
Percoll在離心場中的沉降形成密度梯度，因此 Percoll自形成密度梯度曲線的形狀取決于離心轉(zhuǎn)速和離心時間。Percoll是帶負電荷物質(zhì)，離心過程中離子的積聚將影響梯度的穩(wěn)定性。但由于 Percoll顆粒較大（15nm～20nm），擴散很慢，梯度一旦形成，可長時間保持穩(wěn)定。Percoll梯度離心可以直接與樣品混合作自形成密度梯度離心，也可以先離心讓 Percoll自形成梯度再鋪樣品作預(yù)形成梯度離心。
從下圖可以看出用日立 R20A2角轉(zhuǎn)頭（8×50ml，最高轉(zhuǎn)速 20,000rpm）。在 15,000rpm（RCFAV＝20,000×g），初始密度 1.07g/ml，不同離心時間的 Percoll自形成密度梯度曲線（也可以用其他品牌，同類轉(zhuǎn)頭）
密度（g/ml） 從液面算起的離心管水平方向的距離（毫米）
可以看出只要用很短時間，一般高速離心就可以得到我們需要的 Percoll自形成梯度曲線。
對于分離一些較大顆粒樣品，如肝細胞，可以先讓 Percoll離心，自形成梯度，然后將肝細胞勻漿鋪在 Percoll已形成的梯度表面作速率－區(qū)帶密度梯度離心。預(yù)形成梯度用1,000×g，30分或用3,000×g，15分，梯度形成后鋪上勻漿作低速離心（1,000×g），
可以大大減少細胞的破損，自形成梯度形狀取決于轉(zhuǎn)頭幾何尺寸，離心轉(zhuǎn)速和離心時間。 Percoll自形成梯度也可以用于亞細胞構(gòu)造如質(zhì)膜，重線粒體的離心分離。在這方面 Pharmacia-Biosystems AB 公司做了大量的實驗，讀者可以在網(wǎng)上查詢或直接向該公司索取詳細的實驗資料。
附：表（五）用 0.25M蔗糖稀釋配制的 Percoll等滲液的密度
|
Percoll份數(shù) |
0.25M蔗糖份數(shù) |
密度 g/ml |
|
10 |
0 |
1.148 |
|
9 |
1 |
1.136 |
|
8 |
2 |
1.125 |
|
7 |
3 |
1.113 |
|
6 |
4 |
1.101 |
|
5 |
5 |
1.089 |
|
4 |
6 |
1.078 |
|
3 |
7 |
1.066 |
|
2 |
8 |
1.054 |
|
1 |
9 |
1.043 |
|
0 |
10 |
1.031 |
表（六）用 0.15M Nacl稀釋配制的Percoll等滲液的密度
|
Percoll份數(shù) |
0.15M NaCl份數(shù) |
密度 g/ml |
|
10 |
0 |
1.123 |
|
9 |
1 |
1.111 |
|
8 |
2 |
1.100 |
|
7 |
3 |
1.088 |
|
6 |
4 |
1.076 |
|
5 |
5 |
1.065 |
|
4 |
6 |
1.053 |
|
3 |
7 |
1.041 |
|
2 |
8 |
1.029 |
|
1 |
9 |
1.018 |
|
0 |
10 |
1.006 |
參考文獻：
【1】Houssais J.F.(1983) “Iodinated density gradient media ：a practical approach ” P： 43 IRL press. Ltd. Oxford.
【2】Birnie, G.D, Rickwood, D “Biological Separations in iodinated density gradient media , P193, IR1 press, Oxford.
【3】Miloslav, D., Richard, Hinton “Condition for density gradient separations” in “Preparative Centrifugation”. IRL press . Oxford. Uni.press.1992
【4】Rickwood .D. Birnie, G.D “Centrifugal separations in molecular and cell biology ,” Butterworths London(1998)
【5】Rickwood, D. Ford, T. steengard , J “Centrifugation, Essential Data” P.44 John Wiley and Sons 1994
作者：余興明 電話：13764301893,
