實驗材料：

1.    小鼠

2.    HBSS洗滌緩沖液

3.    MACS緩沖液

4.    CD8a（Ly-2）磁珠

5.    結(jié)合緩沖液

6.    biotin-抗CD25（7D4）

7.    Streptavidin-PE

8.    抗PE磁珠

9.    完全RPMI培養(yǎng)基

10.    小鼠CD3⁺T細胞富集柱和1×純化柱緩沖液

11.    15ml離心管，無菌

12.    autoMACS系統(tǒng)和分選柱

13.    30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜

 

實驗方法：

1.    用20只小鼠的淋巴結(jié)制備單細胞懸液并去除紅細胞。

2.    將細胞在20mlHBSS洗滌緩沖液中混懸后用血細胞計數(shù)器計數(shù)。

3.    將細胞懸液在4℃，200g離心10min。離心過程中，準備3支小鼠CD3⁺T細胞純化柱，按說明書的指導(dǎo)用1×純化柱緩沖液洗3遍。棄洗脫液，在每支純化柱下方放置一支15ml離心管。

4.    用3ml 1×純化柱緩沖液和3ml HBSS洗滌緩沖液混懸細胞。將細胞通過30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜后，每支純化柱中加入2ml細胞。室溫孵育15min。

5.    用2ml 1×純化柱緩沖液洗滌純化柱4或5遍以洗脫T細胞。用血細胞計數(shù)器計數(shù)后，將細胞懸液在4℃，200g離心10min。

6.    將沉淀按每10⁸個細胞加0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每10⁸個細胞加入0.1ml CD8a（Ly-2）磁珠后4℃孵育15min。

7.    4℃，200g離心10min。

8.    以MACS緩沖液混懸細胞，使細胞濃度達到10⁸個細胞/ml。將細胞通過30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜。將細胞放到autoMACS的上樣通道。選擇depletes程序（CD4⁺ T細胞將從陰性通道洗脫。

9.    回收細胞計數(shù)，在4℃，200g離心10min。

10.    用結(jié)合緩沖液混懸細胞使其濃度達到10⁸個細胞/ml。每10⁸個細胞加入15mg biotin-抗CD25（7D4）。4℃孵育15min。4℃，200g離心10min。

11.    用結(jié)合緩沖液混懸細胞使其濃度達到10⁸個細胞/ml。每10⁸個細胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。

12.    4℃，200g離心10min.

13.    用MACS緩沖液混懸細胞使其濃度達到10⁸個細胞/ml。每10⁸個細胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。

14.    4℃，200g離心10min。

15.    用MACS緩沖液混懸細胞使其濃度達到10⁸個細胞/ml。將細胞放到autoMACS的上樣通道。選擇posseld程序（CD4⁺ CD25⁺細胞將從陽性通道洗脫，CD4⁺ CD25^-細胞將從陰性通道洗脫。