MagNA Pure 96 DNA及病毒核酸試劑盒：兼顧快速和高產(chǎn)率的全新解決方案
新的MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸試劑盒：
兼顧快速和高產(chǎn)率的全新解決方案
Michael Kirchgesser*, Agnes Aschenbrenner, Irene Huber, Sarah Müller, Heike Girgnhuber, Hubert Schuldlos, Anna Werner, Werner Malmberg, Robert Steiner, Martin Victor, Thomas Kirschbaum, Claudia Kappelsberger, Michael Knoll, and Peter Wenzig
德國匹茨堡，羅氏應(yīng)用科學(xué)部
*通訊作者：
前言
MagNA Pure 96是最近進入市場的一種全新儀器：它是一種全自動、超高速的系統(tǒng)，它能用于將高質(zhì)量核酸從各種樣品類型中高速分離，1小時以內(nèi)即可完成多至96個樣本的自動純化，處理的樣品容量最高達到1 ml。該系統(tǒng)采用裝有預(yù)裝式即用型試劑的優(yōu)化試劑盒，并配有相應(yīng)的自動分離方法。 這種試劑盒的配置基于沿用已久的磁珠技術(shù)，后者成功用于不同的MagNA Pure系統(tǒng)已有多年。MagNA Pure 96試劑盒由配有不同預(yù)裝式密封緩沖液容器的試劑盤和含磁粉的專用瓶組成。
可提供的所有試劑盒都有小容量（SV）和大容量（LV）的不同規(guī)格，可根據(jù)要處理的樣品量決定。 本文描述了2種MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸試劑盒及其方法的特征和性能。
圖1：試劑盒組件。
試劑盒、試劑盤、磁珠瓶。材料和方法
新的試劑盒及方法是用人EDTA血漿、枸櫞酸鹽血漿、血清和全血以及培養(yǎng)細胞（K562和HeLa）作為樣品材料開發(fā)和測試的。
全血不需要經(jīng)過預(yù)處理即可用于基因組DNA分離。 培養(yǎng)細胞小球在使用前要懸浮于PBS中。
在病毒核酸分離時，使用前在樣品中添加不同量的DNA病毒（巨細胞病毒、EB病毒、細小病毒B19）和RNA病毒（甲型肝炎病毒、甲型H1N1流感病毒）。然后用移液管將樣品移入MagNA Pure 96儀器上的MagNA Pure 96處理盒中。所有樣品至少以8倍復(fù)制進行試驗。 根據(jù)實驗需要，純化核酸的洗脫體積被設(shè)定為50μl、100μl或200μl。在LightCycler® 480儀器上采用吸光度（OD）測定、瓊脂糖凝膠電泳和/或參數(shù)特定的定量實時PCR和RT-PCR分析對洗脫液進行分析。采用15μl各自混合母液和5μl各自洗脫液建立擴增反應(yīng)，運行45個循環(huán)。
結(jié)果和討論
一般特征
試劑盒的組成：排列在試劑盤中的預(yù)裝式試劑容器，便于加載；分開放置、含磁珠（MGP）懸液的瓶子（圖1）。試劑盤和瓶子都在運行前放入儀器抽屜中各自的位置。使用后容器可以方便地重新密封，并保存以待必要時進行后續(xù)的運行。MGP瓶具有特殊的瓶蓋，可以在儀器的針穿過后自動重新密封。所有組件在室溫下都能保持穩(wěn)定。
MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸小容量規(guī)格用于從200μl全血，或從5×105個培養(yǎng)細胞中分離基因組DNA。 它還可以從200μl血漿、血清或全血中分離病毒DNA或RNA。試劑盒包括3個預(yù)裝式試劑容器，每個容器最多可進行192次反應(yīng)（即每個試劑盒進行576次純化）。
MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸試劑盒大容量規(guī)格用于從500μl或1000μl全血或從106個培養(yǎng)細胞中分離基因組DNA。 它能從500μl血漿、血清或全血，或從1000μl血漿或血清中分離病毒DNA或RNA。試劑盒包括3個預(yù)裝式試劑容器，每個容器最多可進行96次反應(yīng)（500μl）或48次反應(yīng)（1000μl）（即每個試劑盒分別進行288或144次純化）。
如果需要的話，試劑盒可用于不同的優(yōu)化方法，包括外部溶解方法可供選用，從而允許在MagNA Pure 96儀器外進行病毒滅活。 對于所有方法，核酸從不同容量的樣品中都可以方便地洗脫，樣品的不同容量可以由用戶選擇。
基因組DNA
圖2： 對血液中分離的DNA的瓊脂糖凝膠（顯示20個復(fù)本）。 在21 kb位置的DNA帶顯示了分離DNA的高完整度。 （M=分子量標記III）
基因組DNA的分離及其后續(xù)分析顯示可重復(fù)性、產(chǎn)量、完整度和純度都很高。根據(jù)瓊脂糖凝膠分析，DNA片段平均顯著大于20 kb（圖2）。
表1總結(jié)了典型的DNA產(chǎn)率和純度。請注意產(chǎn)率顯著依賴于血細胞數(shù)，因此變化可能達到2倍。
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表1：典型的DNA產(chǎn)量和純度 | ||||
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樣品類型 |
樣品量 |
DNA產(chǎn)量 （μg） |
DNA純度 （OD260/280） |
試劑盒類型 |
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血 血 培養(yǎng)細胞 培養(yǎng)細胞 |
200 μl 500 μl 5 x 105 1 x 106 |
6.6 μg 16.5 μg 10.4 μg 22.0 μg |
1.9 2.0 2.0 2.0 |
SV SV |
如LightCycler® 480儀器中進行的PCR之前的稀釋實驗所示（數(shù)據(jù)未顯示），DNA也被證明不含PCR抑制劑。
用不同量的血液與樣品檢測了該程序的可量測性。結(jié)果見圖3。
圖3： 可量測性。 從不同量血液中分離的DNA的瓊脂糖凝膠分析顯示純化法的可量測性良好。
病毒核酸
線性范圍
達到了純化病毒DNA和RNA的高產(chǎn)率。從較寬的濃度范圍分離病毒核酸是可能的（圖4）
圖4： 線性范圍。 每份樣品中加樣濃度為10-106拷貝的Epstein-Barr病毒（EBV）DNA和甲型肝炎病毒RNA的分離。
內(nèi)部質(zhì)控和可重復(fù)性
MagNA Pure 96系統(tǒng)能在每次分離反應(yīng)中都包括一次內(nèi)部質(zhì)控（IC）。 IC從機載IC管中自動移入每個孔中的溶解緩沖液中。 在一次純化操作的所有96個孔中，采用稀釋的細小病毒B19質(zhì)粒作為IC，陰性血清作為樣品材料來檢查該功能。 IC的分離具有很高的可重復(fù)性（圖5）。
圖5： 內(nèi)部質(zhì)控品。 從所處理樣品盒的所有96個孔中分離出的細小病毒B19內(nèi)部質(zhì)控品的PCR分析。
交叉污染試驗
進行這些試驗是為了考查MagNA Pure 96儀器上可能孔間污染的程度。 細小病毒B19被選作這些試驗的敏感參數(shù)；檢測極限大約為每次PCR 2.5個拷貝。 然后以5×107拷貝/ml（=檢測極限以上106倍）向血漿加樣，用大容量方法（500μl樣品）和50μl洗脫體積在MagNA Pure 96儀器處理。
進行3次“棋盤式”運行（每次有48份陽性加樣血漿樣品和48份陰性未加樣血漿樣品排列成棋盤狀）。 在LightCycler® 480儀器上對洗脫液進行分析。 在這些條件下未發(fā)現(xiàn)交叉污染（圖6）。
圖6： 交叉污染試驗。 48份陽性和48份陰性樣品排列成棋盤狀，經(jīng)過處理，進行交叉污染分析。所有陰性樣品鑒定結(jié)果均為“陰性”，而所有陽性樣品和所有質(zhì)控品都顯示了預(yù)期的信號。 該試驗重復(fù)了3次，均得到相同的結(jié)果。
“血漿用”和“通用”方法
在方法優(yōu)化期間發(fā)現(xiàn)，有些樣品材料（即：血清、全血和枸櫞酸鹽血漿）在與“標準”材料EDTA血漿不同的工作流程下能得到更好的結(jié)果。 因此，在“血漿用操作方法”之外，還提供另一種“通用操作方法”，后者能使這些樣品類型得到更好的結(jié)果（達到5個交叉閾值）。 選用“通用操作方法”這個名稱是因為這些方法對于血清、全血和枸櫞酸鹽血漿，優(yōu)于“血漿用操作方法”；而對于EDTA血漿，至少對所檢測的病毒（甲型肝炎病毒、甲型H1N1流感、EB病毒、巨細胞病毒）是與“血漿用操作方法”相等的。 由于結(jié)果可能隨個別實驗設(shè)備和所檢測參數(shù)的不同而變化，因此在儀器的方法菜單中提供不同的方法供選擇，使用戶能選擇對實際應(yīng)用的最佳解決方案。
結(jié)論
新的MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸試劑盒能從多種樣品材料中全自動高效分離DNA和病毒核酸，具有高速和高產(chǎn)率。用戶可以根據(jù)特殊需要在幾個不同方法間作出選擇。此外，該試劑盒所能用處理的樣品容量范圍也很大。因此，對于檢測工作量大的實驗室來說，新的試劑盒將成為有用的工具。
| 產(chǎn)品 | 包裝大小 | 編號 |
| MagNA Pure 96高通量全自動核酸分離純化系統(tǒng) | 儀器、質(zhì)控品、軟件、所有配件 | 05 195 322 001 |
| MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸小容量試劑盒 | 3×192次純化 | 05 467 497 001 |
| MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸大容量試劑盒 | 3×96次純化 | 05 467 454 001 |
| MagNA Pure 96細胞RNA小容量試劑盒 | 3×192次純化 | 05 467 543 001 |
| MagNA Pure 96細胞RNA大容量試劑盒 | 3×96次純化 | 05 467 535 001 |
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