ELISPOT技術(shù)原理　

隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，使體外檢測各種細(xì)胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)以往常用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細(xì)胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細(xì)胞和CK分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對(duì)探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：

1、ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。
2、ELISPOT通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測細(xì)胞因子生成量，還需檢測分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）
3、由于是單細(xì)胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從 20萬-30萬 細(xì)胞中檢出 1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。
4、捕獲抗體為BD、R&D、Mabtach生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。

ELISPOT檢測原理：ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術(shù)原理與ELISA相似。其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是在96微孔培養(yǎng)盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)分離處理后，會(huì)被分配到微孔盤上，再接受適當(dāng)?shù)目乖�刺激，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養(yǎng)一段時(shí)間。一般而言，記憶型T細(xì)胞在受抗原刺激數(shù)小時(shí)后會(huì)開始分泌細(xì)胞激素，此時(shí)局部(在緊靠分泌細(xì)胞的周圍)分泌出的細(xì)胞激素會(huì)被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細(xì)胞被移除并清洗后，被捕獲的細(xì)胞激素可進(jìn)一步使用生物素（Biotin）標(biāo)記的二次抗體來標(biāo)志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細(xì)胞會(huì)留下約10-20mm大小染色的斑點(diǎn)。

ELISPOT技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：移植中排斥反應(yīng)的預(yù)測、疫苗發(fā)展、Th1/Th2分析、自身免疫病研究、腫瘤研究、過敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原決定簇圖譜分析、化合物和藥物免疫學(xué)反應(yīng)的篩選等等。

ELISPOT實(shí)驗(yàn)方法

現(xiàn)介紹檢測人現(xiàn)介紹檢測人IFNγ為例的PVDF  Eli-spot法，僅供參考。
試劑盒內(nèi)容：PVDF96孔板，室溫保存；0.1ml捕獲抗體，4℃保存；0.1ml生物素標(biāo)記檢測抗體，4℃保存；15ul親和素堿性磷酸酶標(biāo)，4℃保存；0.25g牛血清白蛋白，4℃保存；0.25g脫脂乳，4℃保存；11ml底物緩沖液，4℃保存；11ml濃縮PBS（10X），室溫保存；11ml濃縮洗滌液（200x），室溫保存

自備材料/試劑： 細(xì)胞培養(yǎng)液，CO2孵育箱，70%酒精
直接的和間接的Eli-spot法

可在已包被抗體的孔中直接刺激細(xì)胞（直接法），或在24孔板或燒瓶中先刺激細(xì)胞，然后放入已包被的孔中（間接法）。使用哪種方法基于：1）檢測細(xì)胞的類型；2）希望得到的細(xì)胞量。如果只需少量的細(xì)胞因子生成細(xì)胞，使用直接法；如果細(xì)胞因子生成細(xì)胞較多，最好使用間接法。其它步驟一致。

 刺激方法：建議用PMA和婁諾霉素刺激PBMC，使其產(chǎn)生IFNγ。

在培養(yǎng)液中稀釋PBMC（如：RPMI 1640加2mM谷氨酸鹽和10%加熱失活的小牛血清），其中含1ng/ml PMA和500ng/ml婁諾霉素（Sigma, Saint Louis, MO）。加2.104至5.104個(gè)細(xì)胞到抗體包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小時(shí)。其它的刺激劑孵育時(shí)間可能不同，基于細(xì)胞因子生成細(xì)胞的量，按不同情況作最佳選擇。

試劑的準(zhǔn)備：1. 10ml磷酸緩沖鹽（PBS，10X）以90ml蒸餾水稀釋；2. 0.22g脫脂乳用11ml稀釋的PBS溶解，最終濃度為2%；3. 0.22gBSA溶解于22ml已稀釋的PBS，最終濃度為1%；4. 10ml濃縮洗滌液（200x）以1990ml蒸餾水稀釋；5. 10ul親和素堿性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀釋6. 7ml酒精以3ml蒸餾水稀釋，最終濃度為70%。

Eli-spot操作過程：
1.用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。
2.倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次。
3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul， 蓋上板蓋，4℃過夜。
4.倒去液體，100ul PBS洗滌一次。
5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS（見試劑準(zhǔn)備），蓋上板蓋，室溫下孵育2小時(shí)。
6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
7.用100ul PBS洗滌一次。
8.每孔加入100ul細(xì)胞懸浮液（含適當(dāng)量的細(xì)胞和相應(yīng)濃度的刺激劑）。細(xì)胞可預(yù)先在體外接受刺激（間接Eli-spot）。蓋上標(biāo)準(zhǔn)的96孔板塑料板蓋，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時(shí)間（15-20小時(shí)）。這期間不要晃動(dòng)或移動(dòng)孔板。
9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。
11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次。
12.于10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時(shí)30分。
13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時(shí)。
15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT。
17.室溫下反應(yīng)5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤中。
18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時(shí)，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點(diǎn)數(shù)。4℃下放置一夜，點(diǎn)會(huì)比較明顯。

此板在室溫下避光保存。

使用時(shí)應(yīng)注意BCIP/NBT緩沖液是潛在的至癌物質(zhì)，試驗(yàn)時(shí)帶手套，使用后適當(dāng)處理。對(duì)MAIPAN4510板，孵育時(shí)由于毛細(xì)作用，試劑滲入膜中，此液體難以洗去，因此導(dǎo)致背景增加。為了避免此情況，建議在步驟12時(shí)將板底移去，將膜倒轉(zhuǎn)，用蒸餾水流沖洗，同時(shí)用洗滌緩沖液按正常的步驟洗滌。在步驟14中，由于板底已移去，建議將MAIP4510板放于空的96孔板上，其后的步驟不變。