ELISPOT酶聯(lián)免疫斑點分析簡介
ELISPOT 技術(shù)簡介
隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用 , 使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA ）檢測體液中游離的細胞因子（ CK ）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或 CK 的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及 CK 的水平。 80 年代，國外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ ELISPOT ）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。
ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細胞產(chǎn)生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：
- ELISA 通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。
- ELISPOT 也是通過顯色反應(yīng)，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過德國AID的ELISPOT 分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)， 1 個斑點代表 1 個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）
- 由于是單細胞水平檢測， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從 20 萬 -30 萬細胞中檢出 1 個分泌該蛋白的細胞。
- 捕獲抗體為 BD 、 R&D 、 Mabtech 、 Diaclone 生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。
ELISPOT 檢測原理
細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后， 被捕獲的細胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，應(yīng)用德國AID的ELISPOT 酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)可以對斑點進行分析得出結(jié)果。
ELISPOT 分析儀的出現(xiàn)解決了以下問題
- 哪些斑點是抗原特異性 T 細胞產(chǎn)生的（此斑點具有進一步分析價值），哪些是無關(guān)細胞產(chǎn)生的（此斑點沒有 T 細胞研究價值）
- 斑點大小的意義
- 在對不同細胞因子計數(shù)和分析時，如何定義斑點最大和最小尺寸
- 如何從單個細胞基礎(chǔ)上分析
- 實驗精確度有多高？如果一個細胞產(chǎn)生相似的細胞因子，在多大程度上會干擾分析結(jié)果？
幾次重復(fù)實驗才能使結(jié)果更有意義？
簡介ELISPOT技術(shù)
ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術(shù)原理與ELISA相似。其實驗設(shè)計是在96微孔培養(yǎng)盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細胞經(jīng)適當(dāng)分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當(dāng)?shù)目乖碳�，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養(yǎng)一段時間。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數(shù)小時后會開始分泌細胞激素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素（Biotin）標(biāo)記的二次抗體來標(biāo)志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細胞會留下約10-20mm大小染色的斑點。
ELISPOT技術(shù)的過去
ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。Czerkinsky 等人率先在1983年，運用該技術(shù)成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細胞頻率。從那時起世界各國免疫學(xué)者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術(shù)競賽，每個團隊都希望能率先將此一技術(shù)推廣來研究T細胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實驗的環(huán)境，藉由偵測T細胞分泌的各類細胞因子，來定量機體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預(yù)測體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進行的下游免疫反應(yīng)。
ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說操作簡單，但該技術(shù)并沒能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細胞免疫走向T細胞免疫的產(chǎn)生的第一個主要問題，便是靈敏度的提升，因為T細胞因子較之B細胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個技術(shù)性的問題，使當(dāng)時多數(shù)研究團隊很難獲得清晰的斑點，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細胞分泌的各類細胞因子能在細胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)薄膜（Panel B）并行實驗的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過完全相同的實驗，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點。
ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說操作簡單，但該技術(shù)并沒能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細胞免疫走向T細胞免疫的產(chǎn)生的第一個主要問題，便是靈敏度的提升，因為T細胞因子較之B細胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個技術(shù)性的問題，使當(dāng)時多數(shù)研究團隊很難獲得清晰的斑點，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細胞分泌的各類細胞因子能在細胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)薄膜（Panel B）并行實驗的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過完全相同的實驗，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點。
第二個技術(shù)性問題是ELISPOT Cytokine實驗分析的幾個基本假設(shè)缺乏科學(xué)實證，也使得該技術(shù)在當(dāng)時并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎(chǔ)但很重要的問題，諸如；
· 實驗所得的斑點是抗原特定T細胞所生產(chǎn)，還是旁觀細胞受Cytokine刺激的次級效應(yīng)？
· 斑點的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？
· 能否相信斑點是由單一的細胞造成？ · ELISPOT Cytokine分析技術(shù)能準(zhǔn)確測量的頻率范圍？ · 如果效應(yīng)相互拮抗的cytokine同時產(chǎn)生，它們是否會互相妨礙？及到什么程度？
ELISPOT 技術(shù)的現(xiàn)在
1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材等技術(shù)改良，ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達到科研人員的期待，它已是當(dāng)世公認(rèn)最靈敏抗原特定T細胞的體外檢測技術(shù)。藉由檢驗新鮮分離PBMC細胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術(shù)可提示T細胞免疫系統(tǒng)的兩個重要參數(shù)：抗原特定T細胞的clone族群大�。缓兔庖咝�(yīng)細胞的信號傳導(dǎo)路徑Th1/Th2。
多年來經(jīng)過數(shù)十個研究團隊的致力研究，對于ELISPOT分析技術(shù)本身的幾個問題，也有了科學(xué)上的驗證。目前一般公認(rèn)，ELISPOT技術(shù)允許科研人員在單細胞水平上識別抗原特定T細胞，主要針對經(jīng)由CD4或者CD8細胞的免疫反應(yīng)。在適當(dāng)?shù)膶嶒炘O(shè)計下，ELISPOT Cytokine 斑點的數(shù)量分析顯示斑點是由一個單細胞所生成，同時斑點形態(tài)學(xué)與Time Response分析則顯示斑點直徑大小直接反映該細胞族群的產(chǎn)能。也因為如此，ELISPOT是個免疫學(xué)上的標(biāo)竿技術(shù)，它可以允許科研人員在幾乎自然生理條件下，觀察細胞實際分泌Cytokine的進程，進而可以得到藥理學(xué)信息，闡明免疫調(diào)節(jié)藥物如何影響T細胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制T細胞免疫一般可通過兩程截然不同的機轉(zhuǎn)；使能分泌Cytokine的Precursor T細胞族群變小，或減少每Precursor T細胞的cytokine產(chǎn)能，而ELISPOT技術(shù)能提供雙份信息。
 |
 |
|
上圖：典型Elispot Plate Layout 右圖：實驗結(jié)果 | |
ELISPOT分析技術(shù)的幾個特點已經(jīng)讓它在抗原特定T細胞免疫學(xué)上獨占鰲頭。此技術(shù)是當(dāng)世唯一準(zhǔn)許百萬分之一1:1000,000的準(zhǔn)確分析，如此強效的解析力使流式細胞技術(shù)也望其項背，以目前國內(nèi)外常規(guī)的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術(shù)的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對T細胞免疫學(xué)研究是必須的，因為抗原特定T細胞一般在機體周邊循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的頻率通常低于萬中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術(shù)被證實適用于冰凍后復(fù)蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當(dāng)?shù)男r，沒有喪失功能。這一點對臨床試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗牽涉全國多個臨床試驗機構(gòu)，病人血樣可冰存并同時集中在「中央實驗室」一齊被測試。同理，一個血樣或標(biāo)準(zhǔn)對照品可被分裝小份，被送到不同檢驗中心進行測試，以交互比對，同時有利LISPOT Cytokine技術(shù)流程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。
流式細胞intracellular cytokine技術(shù)之靈敏度僅是萬中取一
ELISPOT 斑點的判讀
像多數(shù)的Cell-based分析技術(shù)一樣，ELISPOT Cytokine技術(shù)也是相當(dāng)耗時、耗勞力的工作。事實上到目前為止，以目視法判讀少量細胞族群的特性如激活T細胞之激素分泌，仍被視為是免疫學(xué)技術(shù)上的一大挑戰(zhàn)。ELISPOT結(jié)果的判讀常需要專聘、有經(jīng)驗的技術(shù)員才可以；有時就算有專職技師判讀，使用傳統(tǒng)的顯微鏡計算斑點數(shù)仍不免會偶有主觀意見，而有所偏頗。
科學(xué)實證的本質(zhì)，在于如何使實驗結(jié)果能盡可能客觀、精確、同時有高重現(xiàn)性，傳統(tǒng)的人工計算法顯然無法達到此一要求。這就是Elispot Reader酶聯(lián)斑點分析儀應(yīng)運而生。分析ELISPOT實驗數(shù)據(jù)的過程中，Elispot Reader儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后儲存成TIF檔；這些影像可以進一步使用手動、或是自動方式計算斑點數(shù)目，如果使用Elispot Reader分析軟件，可以先設(shè)定條件，然后同時分析斑點的大小，以推估激素分泌的多寡。預(yù)料像Elispot Reader這一類自動圖像掃描分析儀器，將可克服傳統(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費人力、及人為客觀性等缺點，徹底解除ELISPOT分析技術(shù)的瓶頸問題，進一步推廣該技術(shù)的新穎應(yīng)用。
Elispot Reader可以提供不同的數(shù)據(jù)格式，包括未處理與處理過的膜表面影像、每個小孔中的斑點數(shù)目、每個小孔中的平均斑點數(shù)目、每個小孔中斑點大小的直方統(tǒng)計圖。
ELISPOT 未來展望
據(jù)筆者的觀察，ELISPOT 分析技術(shù)正在歐美各國發(fā)揮它的完整潛能，它讓免疫學(xué)家可以直接洞察活體內(nèi)T細胞相關(guān)生理學(xué)或病理學(xué)，就像是心臟外科醫(yī)師手上的那張心電圖，經(jīng)由這個技術(shù)科研人員可以在活體內(nèi)直接進入一個器官系統(tǒng)，在那里視察、發(fā)掘，得到全新的智識。
從各國文獻可見ELISPOT技術(shù)已經(jīng)達到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的要求，并被廣泛地應(yīng)用在多項領(lǐng)域，包括監(jiān)視癌癥病人接受免疫療程時的反應(yīng)(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫病人體內(nèi)的一個特定的免疫反應(yīng)型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術(shù)同時也在數(shù)個疫苗效價評估人體試驗中，被當(dāng)成重要的終結(jié)指針。2003年1月，世界衛(wèi)生組織通過與大陸北京性艾中心合作，將應(yīng)用ELISPOT技術(shù)來監(jiān)測HIV疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)技術(shù)，該計劃是首次利用ELISPOT技術(shù)對亞洲國家從事HIV疫苗研究和臨床試驗的有關(guān)研究。我們期待未來此一技術(shù)能在我國免疫學(xué)界得到廣泛地應(yīng)用。
其它ELISPOT應(yīng)用范圍
· 移植研究 – allograft rejection
· 疫苗開發(fā) -亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響
· Th0/Th1/Th2細胞轉(zhuǎn)換分析
· 自體免疫研究 – 免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究
· 癌癥研究 -腫瘤反應(yīng)T細胞作用
· 過敏機制探討 – IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過敏機制之細胞激素研究
· 傳染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等
· 抗原決定位定圖
· 體液免疫力研究 – B細胞免疫球蛋白及特定亞型反應(yīng)的進展研究
ELISPOT 應(yīng)用領(lǐng)域
- 自身免疫檢測
- 器官移植
- 疫苗和藥品的研發(fā)與檢測
- T 細胞功能研究
- 腫瘤研究
- 傳染病的研究和檢測
- 病毒研究等。
目前使用ElispotReader的部分研究領(lǐng)域如下
- 單細胞解析度/體外抗原特異性 T 細胞頻率的準(zhǔn)確測量
- 測量 1 類和 2 類免疫力
- T 細胞的同源性細胞因子產(chǎn)物與旁細胞因子產(chǎn)物
- 功能性 T 細胞親和力的測量
- 細胞因子協(xié)同表達 / 雙色 ELISPOT
- 斑點尺寸分布
- PBMC的體外測量的分析到分析的重可生產(chǎn)性
- 新鮮和低溫儲藏后的人類PBMC的比較
- CD 8+ T 細胞和CD8+ T 細胞和 Granzyme B 的 ELISPOT 分析
- 除了人類 PBMC 、鼠淋巴結(jié)/脾臟細胞以外的細胞的 ELISPOT 分析
- 免疫與佐藥
- 腫瘤免疫
- 移植免疫
ELISPOT 技術(shù)優(yōu)勢
 |
|
圖注：ELISPOT 法在檢測低頻率產(chǎn)生細胞因子的細胞時具有獨一無二的敏感性。將指定數(shù)目的能產(chǎn)生 IFN- 的T細胞與一百萬個抗原呈現(xiàn)細胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上圖）、胞質(zhì)內(nèi)染法（中圖）和 ELISA 法（下圖）分別測量產(chǎn)生 IFN- 的細胞的數(shù)目。 ELISPOT 分析使單細胞分泌產(chǎn)物可視化。這些分析異常敏感，因為它是在直接在分泌細胞的周圍進行捕捉，而且是在表面被沖淡，或者被臨近的細胞上的受體捕獲，或降解之前。
|
- 最低至1：100萬細胞精度的活體外頻率測量。這種分辨率已經(jīng)遠遠超過使用細胞內(nèi)細胞因子的四聚物染色和 ELISA 法測量的精度。這種高敏感度是非常關(guān)鍵的，因為抗原特異性 T 細胞在體外都是典型性的低頻率。
- 高產(chǎn)量 T 細胞分析成為可行。一個經(jīng)過訓(xùn)練的相關(guān)實驗室小組可以測試成百的樣本中幾十種抗原的反應(yīng)。
- 只需要少量細胞，就可以用于通其他細胞學(xué)分析方法進行比較。例如，45毫升的血液就足以用于測試600種不同抗原/肽類物質(zhì)的反應(yīng)。
- 可以定義CD4和CD8細胞的免疫因子指標(biāo)。這是因為只需要少數(shù)細胞，分析就可以在高產(chǎn)量模式下進行。ELISPOT 分析在篩選肽庫，繪制免疫因子方面是一個理想的工具。
- 用于確定抗原特異性 T 細胞的功能性親和力。這最大可能受到肽類藥物刺激至50%的影響。
- 可以用于研究未經(jīng)藥物處理過的細胞的分泌過程。如果觀察到凈產(chǎn)量減少，可以確定這種區(qū)別是來自于分泌細胞的減少，還是每個細胞分泌產(chǎn)量的減少。
- 淋巴細胞在 ELISPOT 分析后依然存活。這使得分析之后進行增值，用于更進一步的分析、克隆或者低溫儲藏成為可能。
- 低溫儲藏后的人類淋巴細胞可以用于檢測，而不會丟失其功能。治療前和治療后的樣本可以并排進行測試，結(jié)果可以重復(fù)。
萊比信（中國）科技發(fā)展有限公司
地 址: 北京市通州區(qū)瑞都國際中心0806室
郵 編: 101121
電 話: 010-60520271/0122/0339/0815
傳 真: 010-81570221
地 址: 北京市通州區(qū)瑞都國際中心0806室
郵 編: 101121
電 話: 010-60520271/0122/0339/0815
傳 真: 010-81570221
Email: info@lab-sun.com
www.lab-sun.com /www.lab-sun.cn
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com