實時熒光定量PCR在人感染豬流感診斷中的作用

彭年才¹²  張鎮(zhèn)西¹  蘭鄒然³  黃兵³  李紅東²  李明²   苗保剛²

¹西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù)與儀器研究所 ²西安天隆科技有限公司 ³山東省動物疾病預(yù)防與控制中心

2009年4月30日

摘要：病原檢測方法及儀器是人感染豬流感防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，針對實時熒光定量PCR分子診斷核酸檢測技術(shù)的先進(jìn)性以及國產(chǎn)試劑和儀器的成熟性，本文分析了該技術(shù)在以往禽流感檢測被采用的國家標(biāo)準(zhǔn)以及使用的廣泛性，最后介紹了最新發(fā)布的美國CDC《針對人感染豬流感病毒治療和預(yù)防的臨時指南》和我國衛(wèi)生部《人感染豬流感預(yù)防控制技術(shù)指南（試行）》，兩部法規(guī)都將實時熒光定量PCR確定為人感染豬流感實驗室檢測的確診方法。從以上情況可以獲知：實時熒光定量PCR技術(shù)在人感染豬流感診斷中具有先進(jìn)、快速、成熟、合法的特點，是一種法定的主流技術(shù)，將來實施中，國產(chǎn)化儀器和試劑都有保障。

關(guān)鍵詞：人感染豬流感  豬流感診斷  快速檢測  實時定量PCR  Real-time RT-PCR

全球性的人感染豬流感公共衛(wèi)生事件發(fā)展勢頭迅猛，發(fā)生國家眾多，世界衛(wèi)生組織29日晚已將全球流感大流行警告級別從4級提高到5級，我國也于28日召開了國務(wù)院常務(wù)會議對防控進(jìn)行了部署�，F(xiàn)在已進(jìn)入關(guān)鍵的防控措施落實階段，其中檢測與診斷技術(shù)至關(guān)重要。

眾所周知，雖雖然本次人感染豬流感事件的病毒基因序列還在進(jìn)一步確立當(dāng)中，但本次疫情病原學(xué)基礎(chǔ)明確，屬于RNA病毒感染性疾病�；仡櫧�年來感染RNA病毒的烈性傳染病，如SARS、禽流感，世界衛(wèi)生組織及我國衛(wèi)生行政和技術(shù)部門相繼制定了較為成熟的實驗室檢測和診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中我國頒布的應(yīng)用實時熒光定量PCR方法進(jìn)行實驗室檢測和快速診斷的標(biāo)準(zhǔn)如《GB/T 19438.1—2004禽流感病毒通用熒光RT—PCR檢測方法》、《GB/T 19438.2—2004 H5亞型禽流感病毒熒光RT—PCR檢測方法》、《GB/T 19438.3—2004 H7亞型禽流感病毒熒光RT—PCR檢測方法》等，同時我們也注意到近年來國家針對食品安全尤其是乳品檢測和食物致病菌檢測的實時熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)，如《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法：熒光PCR方法》和《SN/T 1870-2007 食品中致病菌檢測方法：實時PCR法》。以上實時熒光定量PCR技術(shù)在禽流感及其它方面檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)是該技術(shù)在當(dāng)前的人感染豬流感診斷中應(yīng)用的基礎(chǔ)和前提。

實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR，如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉(zhuǎn)錄實時PCR即Real-time RT-PCR）是實時PCR法，它是指對DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并實時監(jiān)測DNA的放大過程，在擴(kuò)增的指數(shù)增長期就測量擴(kuò)增產(chǎn)物，因為擴(kuò)增指數(shù)增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關(guān)性，從而實現(xiàn)定量檢測。Real Time PCR的基本目標(biāo)是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監(jiān)測CT值而實現(xiàn)對原始目標(biāo)基因的含量定量。目前被普遍使用的多種常規(guī)PCR方法如各種凝膠電泳PCR法，終點熒光定量法或PCR-ELISA法叫做終點PCR法。實時熒光定量PCR法最大的優(yōu)點是克服了終點PCR法進(jìn)入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。普通PCR技術(shù)發(fā)明于1983年，而實時熒光定量PCR技術(shù)發(fā)明于上世紀(jì)九十年代并于1996年生產(chǎn)出了世界上第一臺實時熒光定量PCR儀，實時熒光定量PCR技術(shù)得以實現(xiàn)的技術(shù)要素主要有熒光定量PCR試劑盒和實時熒光定量PCR儀，我國熒光定量PCR試劑盒研發(fā)實力強(qiáng)大，生產(chǎn)廠家較多，臨床診斷的品種如HBV/HCV及禽流感診斷試劑盒性能優(yōu)良、供應(yīng)充足，基本實現(xiàn)國產(chǎn)化。在豬流感病毒RNA核酸序列明確的情況下，利用現(xiàn)有的試劑研發(fā)平臺，人感染豬流感實時熒光定量PCR診斷試劑盒很快就會面世。實時熒光定量PCR儀由于技術(shù)含量高，只有少數(shù)幾家中國企業(yè)有能力生產(chǎn)如西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的TL-988系列儀器不但取得了發(fā)明專利、國家科學(xué)技術(shù)獎、國家重點新產(chǎn)品證書、醫(yī)療器械注冊證，而且被國家發(fā)改委確立為國家高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程2008年生物醫(yī)學(xué)工程專項，產(chǎn)品性能達(dá)到國際先進(jìn)水平，在乳品檢測行業(yè)市場占有率比進(jìn)口儀器還高^[1-3]。實時熒光定量PCR儀應(yīng)用廣泛，1999年開始，西方發(fā)達(dá)國家嘗試將PCR應(yīng)用于臨床傳染病診斷、食品安全檢測以及血液篩查，目前已相當(dāng)普及。2008年12月13日中國衛(wèi)生部下發(fā)《衛(wèi)生應(yīng)急隊伍裝備參考目錄》（衛(wèi)辦應(yīng)急發(fā)[2008]207號），其中要求縣級以上衛(wèi)生應(yīng)急隊伍建設(shè)中必須配備PCR儀和實時熒光定量PCR儀作為傳染病控制類裝備。

在人感染豬流感病毒出現(xiàn)以前，針對豬與豬傳染的傳統(tǒng)豬流感疫情，近年來我國科技人員經(jīng)過不懈努力，探索快速檢測與診斷方法，發(fā)表了一系列應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測的研究論文^[4-5]。

人感染豬流感疫情發(fā)生后，美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）于2009年4月28日發(fā)布了針對人感染豬流感病毒治療和預(yù)防臨時指南，西安天隆科技有限公司在第一時間將其翻譯成中文版本^[6]。其中規(guī)定了確診病例的診斷方法：具有急性發(fā)燒呼吸道疾病的臨床癥狀并且經(jīng)實時熒光定量PCR (real-time RT-PCR)或病毒分離培養(yǎng) (viral culture)實驗室檢測方法檢驗證實感染A（H1N1）型豬流感病毒。衛(wèi)生部辦公廳于4月30日印發(fā)了《人感染豬流感預(yù)防控制技術(shù)指南（試行）》的通知》^[7]，其中在實驗室檢測和病例診斷報告章節(jié)，內(nèi)容如下：

呼吸道標(biāo)本應(yīng)首先應(yīng)用real time RT-PCR方法檢測A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及質(zhì)控對照RNP基因。同時，接種MDCK細(xì)胞或SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，并測定病毒的全基因組序列。

 推薦檢測方法

用Real-time RT-PCR方法檢測豬流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。

 其他檢測方法 
快速流感抗原檢測

病毒培養(yǎng)

免疫熒光法（或裝配的IFA ）

顯然，上述衛(wèi)生部法規(guī)中，與“其他檢測方法”不同，實時熒光定量PCR方法被法定為人感染豬流感診斷的推薦檢測方法。

1. Nian-cai Peng（彭年才）, Chun-lin Wang ,Li-li Zhang ,Miao-lin Lu ,Zhen-xi Zhang: Asymmetric PCR method in generation of HBV ssDNA for pyrosequencing, Academic Journal of Xi’an Jiaotong University,VOL.21 No.1,Feb 2009，54-56

2. 彭年才，張鎮(zhèn)西，李明：乳制品中阪崎腸桿菌的快速檢測，食品安全導(dǎo)刊，08.7：96-100

3. 彭年才，蘇明權(quán)，張鎮(zhèn)西：乳品檢測中實時熒光定量PCR儀的研制，中國乳品工業(yè)，200705：62-64

4. 段廷云，陳紅英，崔保安等：實時熒光定量PCR檢測H1N1亞型豬流感病毒，畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008。39（6）：752-756

5. 張春明，喬傳玲，陳艷等，豬流感病毒M基因?qū)崟r熒光定量PCR診斷方法的建立，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008。20（10）：805-809

6. 美國CDC針對人感染豬流感病毒治療和預(yù)防的臨時指南（中英文全文）

7.中國衛(wèi)生部：人感染豬流感預(yù)防控制技術(shù)指南（試行）