一, 毛細(xì)管電泳的興起與發(fā)展

    毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE),又稱高效毛細(xì)管電泳(HPCE)是近年來(lái)發(fā)展最快的分析化學(xué)研究領(lǐng)域之一.1981年Jorgenson等[1]在75μm內(nèi)徑的毛細(xì)管內(nèi)用高電壓進(jìn)行分離,創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管電泳.1984年Terabe等[2]發(fā)展了毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC).1987年比Hjerten[3]建立了毛細(xì)管等電聚焦(CIEF),Cohen和Karger[4]提出了毛細(xì)管凝膠電泳(CGF).1988—1989年出現(xiàn)了第一批CE商品儀器,1989年第一屆國(guó)際毛細(xì)管電泳會(huì)議召開(kāi),標(biāo)志了一門新的分支學(xué)科的產(chǎn)生.短短的幾年內(nèi),由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學(xué)各領(lǐng)域中對(duì)生物大分子(肽,蛋白,DNA等)的高度分離分析的要求,得到了迅速發(fā)展,正逐步成為生命科學(xué)及其它學(xué)科實(shí)驗(yàn)室中一種常用的分析手段.近三年來(lái)國(guó)際毛細(xì)管電泳會(huì)議與會(huì)者均達(dá)700—800人,1996,1997兩年公開(kāi)發(fā)表的有關(guān)CE論文達(dá)3600余篇.可參見(jiàn)相關(guān)綜述則[5-8].歐洲,美國(guó)國(guó)內(nèi)及日本也相繼召開(kāi)CE地區(qū)性國(guó)際會(huì)議.我國(guó)在CE領(lǐng)域研究起步早,發(fā)展快,研究工作較全面,有的研究成果達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平.定期召開(kāi)全國(guó)CE會(huì)議及亞太地區(qū)國(guó)際會(huì)議,在國(guó)際上已有一定的影響.1984年中國(guó)科學(xué)院化學(xué)所竺安教授在國(guó)內(nèi)率先開(kāi)展CE研究,迄今國(guó)內(nèi)已有幾百個(gè)單位開(kāi)展CE研究和應(yīng)用.從CE理論到各種模式及各方面應(yīng)用,國(guó)內(nèi)均在進(jìn)行.1998年舉行的第三屆全國(guó)CE會(huì)議共收錄論文129篇,同時(shí)舉行的第二屆亞太國(guó)際會(huì)議也取得了成功.毛細(xì)管電色譜(CEC),CE/MS聯(lián)用,低背景毛細(xì)管梯度凝膠電泳,手性藥物分離,逆流聚焦及脫氧核糖核酸(DNA)各種CE測(cè)定方法等一批研究成果均達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平.

二, 毛細(xì)管電泳基本原理

    CE是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力.以毛細(xì)管為分離通道,依據(jù)樣品中各組成之間淌度和分配行為上的差異,而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù).儀器裝置包括高壓電源,毛細(xì)管,柱上檢測(cè)器和供毛細(xì)管兩端插入又和電源相連的兩個(gè)緩沖液貯瓶,在電解質(zhì)溶液中,帶電粒子在電場(chǎng)作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象稱電泳.CE所用的石英毛細(xì)管在PH>3時(shí),其內(nèi)液面帶負(fù)電,和溶液接觸形成一雙電層.在高電壓作用下,雙電層中的水合陽(yáng)離子層引起溶液在毛細(xì)管內(nèi)整體向負(fù)極流動(dòng),形成電滲液.帶電粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)溶液中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)二者的矢量和.帶正電荷粒子最先流出;中性粒子的電泳速度為"零",故其遷移速度相當(dāng)于EOF速度;帶負(fù)電荷粒子運(yùn)動(dòng)方向與EOF方向相反,因EOF速度一般大于電泳速度,故它將在中性粒子之后流出;各種粒子因遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離,這就是毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE)的分離原理.CZE的遷移時(shí)間t可用下式表示:
式中,μep為電泳淌度,μen為電滲淌度,V為外加電壓,ιt為毛細(xì)管總長(zhǎng)度,ιd為進(jìn)樣到檢測(cè)器間毛紉管長(zhǎng)度.理論塔板數(shù)N為:
式中,D為擴(kuò)散系數(shù).分離度R為<BR>式中,μ1,μ2分別為二溶質(zhì)的電泳淌度,μep為二溶質(zhì)的平均電泳淌度.
從式(11.2)可看出,CE的N是和溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)D成反比,而高效液相色譜 (HPLC)的N和D成正比,因此擴(kuò)散系數(shù)小的生物大分子,CE的柱效比HPLC高得多.CE比HPLC有更高的分離能力,主要由兩個(gè)因素決定:一是CE在進(jìn)樣端和檢測(cè)時(shí)均沒(méi)有像HP比的死體積;二是CE用電滲流作推動(dòng)流體前進(jìn)的驅(qū)動(dòng)力,整個(gè)流體呈扁平型的塞式流,使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細(xì)管內(nèi)不易擴(kuò)散,而HPLC用壓力驅(qū)動(dòng)使柱中流體呈拋物線型,導(dǎo)致溶質(zhì)區(qū)帶擴(kuò)散,使校效下降
    CE將經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離有機(jī)地結(jié)合,取得了比HPLC和平板凝膠電泳更多的優(yōu)點(diǎn).概括起來(lái)可謂三高二少一廣.高質(zhì)量靈敏度:常用紫外檢測(cè)器檢測(cè)限可達(dá)10-13一10-15mol,激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(LIF)則達(dá)10-19一10-21mol.高分辨率:每米理論塔板數(shù)為幾十萬(wàn),高者可達(dá)幾百萬(wàn)乃至幾千萬(wàn).高速度:許多分析可在幾十秒內(nèi)完成.所需樣品少:只需納升(10-9)的進(jìn)樣量.成本低:只需少量的流動(dòng)相和低廉的毛細(xì)管.應(yīng)用范圍廣;除分離生物大分子外,還可用于小分了(氨基酸,藥物等)及離子(無(wú)機(jī)及有機(jī)離子).甚至可分離各種顆粒(如細(xì)胞,硅膠顆粒等).
    CE發(fā)展迅速也得力于大批色譜工作者轉(zhuǎn)向CE,在理論上提出了各種模型,如解釋CZE中區(qū)帶擴(kuò)展及理論塔板高度模型,熱影響模型,遷移速率和分離度模型等等[9-10].近年來(lái)基礎(chǔ)研究集中于解決CE應(yīng)用中一些關(guān)鍵性問(wèn)題.如EOF對(duì)分離,定量影響極大,故研究了測(cè)弱EOF的方法,陽(yáng)離于存在下的EOF,還有在兩個(gè)中性標(biāo)記物之間夾一個(gè)緩沖液塞的三明治式方法測(cè)定EOF [11].EOF測(cè)定將解決CE定量問(wèn)題.電泳淌度定量計(jì)算也在發(fā)展,如用金屬陽(yáng)離子的一些結(jié)構(gòu)參數(shù),定量得出結(jié)構(gòu)—保留(電泳)間的關(guān)系(QSRR) [12]及計(jì)算手性化合物淌度的軟件等.特別是各種優(yōu)化方法用于優(yōu)化CZE,MECC,CEC及手性分離的實(shí)驗(yàn)參數(shù),如重疊分離譜(OBM),多變量統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)及Plackett-Buman多變量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[13]等.

三, 毛細(xì)管電泳分離模式

    按毛細(xì)管內(nèi)分離介質(zhì)和分離原理的不同,CE現(xiàn)有六種分離模式,分述如后.
1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)
    CZE分離機(jī)理是基于各被分離物質(zhì)的凈電荷與其質(zhì)量比(荷質(zhì)比)間的差異.迄今CZE仍是應(yīng)用最多的模式,應(yīng)用范圍包括氨基酸,肽,蛋白,離子,對(duì)映體拆分和很多其它帶電物質(zhì)的分離.CZE常用介質(zhì)為電解質(zhì)水溶液,根據(jù)情況可加入不同有機(jī)溶劑或其它添加劑.還有一種非水CE,如在乙腈中加入嗡 鹽(tropyltum)來(lái)分離多環(huán)芳烴化合物,現(xiàn)在發(fā)展到可不加支持電解質(zhì),直接用乙腈,甲酰胺,甲醇等作溶劑來(lái)進(jìn)行非水CE[14].
毛細(xì)管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis,CGE)
    CGE是將平板電泳的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行電泳,不同體積的溶質(zhì)分子在起"分子篩"作用的凝膠中得以分離.常用于蛋白質(zhì),寡聚核苷酸,核糖核酸(RNA),DNA片段分離和測(cè)序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物分析.CGE能達(dá)到CE中最高的柱效.為了解決人類基因組計(jì)劃的關(guān)鍵,即DNA測(cè)序的速度,已試制出96支毛細(xì)管陣列的DNA測(cè)序儀,并已有8支毛細(xì)管陣列的DNA測(cè)序商品儀器.凝膠的制備和不同模式令人關(guān)注,最近發(fā)展出—種低背景毛細(xì)管梯度凝膠電泳[15],在測(cè)定糖,寡聚核苷酸及人工模擬蛋白方面取得進(jìn)展.還有報(bào)道采用親和凝膠電泳來(lái)識(shí)別和鑒定基于DNA藥物的結(jié)合蛋白等.
3. 毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(mfcellar electrokinetic capillary chromatography, MECC)
    采用表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉,SDS)在運(yùn)動(dòng)緩沖液內(nèi)形成一疏水內(nèi)核,外部帶負(fù)電的動(dòng)態(tài)膠束相,利用溶質(zhì)具有不同的疏水性,因而在水相和膠束相(準(zhǔn)面定相)間分配的差異進(jìn)行分離,既能分離中性溶質(zhì)又能分離帶電組分的CE模式.MECC拓寬了CE的應(yīng)用范圍,主要用于小分子,中性化合物,手性對(duì)映體和藥物等.常用表面活性劑有各種陰離子表面活性刑,陽(yáng)離子表面活性劑,非離子和兩性表面活性劑.也有用混合膠束,如陰離子表面活性劑和膽酸鹽組合混合膠束.有報(bào)道采用脂肪醇的微乳液膠束電動(dòng)色譜(MEEKC)有比MECC更高的柱效,更快的分析速度和容易控制"窗口" [16].我們也成功地用MEEKC同時(shí)分離測(cè)定酸性和堿性蛋白.
4. 毛細(xì)管等電聚焦(capillary isoelelectric focusing,CIEF)<BR>用兩性電解質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)建立pH梯度,使各種具有不    同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作
用下遷移到等電點(diǎn)的位置,形成窄的聚焦區(qū)帶.已成功地用于測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn),分離<BR>異構(gòu)體等.如用CZE和CIEF研究制備過(guò)程中糖蛋白不同糖基化程度引起的非均一性,<BR>結(jié)果表明CIEF方法要比CZE的好[17].
5. 毛細(xì)管等速電泳(capillary isotachophoresis,CTTP)<BR>采用先導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì).使溶質(zhì)按其電泳淌度不同得    以分離,是一種較老的方式.現(xiàn)在常用作柱前濃縮方法用以富集樣品,以解決CE測(cè)定中濃度靈敏度不如服比的問(wèn)題,如HPLC的問(wèn)題,如在線ITP—CZE即是成功的模式[18].
6. 毛細(xì)管電色譜(capillary electrochromatography,CEC)
    將HPLC中眾多的固定相微粒填充到毛細(xì)管中(或涂漬到管壁).以樣品與固定相之間的相互作用為分離機(jī)制,以電滲流為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力的色譜過(guò)程稱為CEC[19-20]. CEC將CE的高效和HPLC的高選擇性相結(jié)合,得到了CE研究者的青睞.90年代初解決了毛細(xì)管填充技術(shù)后,CEC發(fā)展迅速,HPCE'97會(huì)議上已達(dá)35篇論文,HPCE'98又創(chuàng)54篇之多.CEC可分為開(kāi)管CEC(即管壁涂漬固定相)和填充CEC.我國(guó)學(xué)者在CEC方面作了大量研究工作,對(duì)CEC的理論,反相電色譜,正相電色譜,離子交換電色譜及電色譜手性分離等模式均作了較系統(tǒng)研究[21-23],連續(xù)兩年在國(guó)際CE會(huì)上作大會(huì)報(bào)告,目前已在ODS,硅膠,氰基,胺基,陰,陽(yáng)離子交換樹(shù)脂等10余種填料CEC柱上進(jìn)行研究,開(kāi)管CEC也發(fā)展了一些新技術(shù),如硅膠—溶膠法在管壁涂漬C8固定相[24],分子印刷法分離手性化合物[25].
    以上六種模式為CE基本模式,此外如親和,免疫毛細(xì)管電泳發(fā)展趨勢(shì)亦較好.

四,毛細(xì)管電泳柱技術(shù)

    毛細(xì)管是CE的核心部件之一.早期研究集中在毛細(xì)管直徑,長(zhǎng)度,形狀和材料方面,目前集中在管壁的改性和各種柱的制備.
1. 動(dòng)態(tài)修飾毛細(xì)管內(nèi)壁
    管壁改性主要是消除吸附和控制電滲流,通常采用動(dòng)態(tài)修飾和表面涂層兩類方法.動(dòng)態(tài)修飾采用在運(yùn)行緩沖液中加入添加劑,如加入陽(yáng)離子表面活性劑十四烷基三甲基溴化銨(TTAB),能在內(nèi)壁形成物理吸附層,使EOF反向.添加劑還有聚胺,聚乙烯亞胺(PEI)等,甲基纖維素(MC)可形成一中性親水性覆蓋層.
2. 毛細(xì)管內(nèi)壁表面涂層
    涂層方法有很多種,包括物理涂布,化學(xué)鍵合及交聯(lián)等 最常用的方法是采用雙官能團(tuán)的偶聯(lián)劑,如各種有機(jī)硅烷,第一個(gè)官能團(tuán)(如甲氧基)與管壁上的游離羥基進(jìn)行反應(yīng),使其與管壁進(jìn)行共價(jià)結(jié)合,再用第二個(gè)官能團(tuán)(如乙烯基)與涂漬物(如聚丙烯酰胺)進(jìn)行反應(yīng),形成一穩(wěn)定的涂層.此外還有將纖維素,PEI和聚醚組成多層涂層,親水性的絨毛涂層(fuzzy)和聯(lián)鎖聚醚涂層[6].
3. 凝膠柱和無(wú)膠篩分
   CGE的關(guān)鍵是毛細(xì)管凝膠柱的制備,常用聚丙烯酰胺凝膠栓來(lái)進(jìn)行DNA片段分析和測(cè)序.測(cè)定蛋白質(zhì)和肽的分子量常用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-LPAGE).如將聚丙烯配胺單體溶液中的交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)濃度降為零,得到線性非交聯(lián)的親水性聚合物用作操作溶液,仍有按分子大小分離的作用,稱無(wú)膠篩分.此法簡(jiǎn)單,使用方便,分離能力比CGE差.
4. 毛細(xì)曾填充往等
    CEC填充柱已在前面論述.也有將核糖核酸酶,己糖激酶,腺苷脫氨酶等固定到
毛細(xì)管表面,構(gòu)成一開(kāi)管反應(yīng)器,再和CE連接,可進(jìn)行核酸選擇性檢測(cè),微量在線合成和分離寡核昔酸等工作.另一有意義的工作是用各種方式在毛細(xì)管內(nèi)緩沖液中形成各種梯度,如PH梯度,溶劑濃度梯度等,來(lái)提高分離效率和選擇性.

五, 毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)

     CE對(duì)檢測(cè)器靈敏度要求相當(dāng)高,故檢測(cè)是CE中的關(guān)鍵問(wèn)題.迄今為止除了原子吸收光譜與紅外光譜末用于CE外,其它檢測(cè)手段均已用于CE.現(xiàn)選擇重要的幾類檢測(cè)器介紹其最新進(jìn)展.
1. 紫外檢測(cè)器(UV)
    UV檢測(cè)器集中在提高靈敏度,如采用平面積分檢測(cè)池,這種設(shè)計(jì)可使檢測(cè)光路增加到1cm[26].也有用光散射二極管(LEDS)作光源,其線性范圍和信噪比優(yōu)于汞燈.總體來(lái)說(shuō)進(jìn)展不大.
2. 激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)[LIF]
    LIF是CE最靈敏的檢測(cè)器之一,極大地拓展了CE的應(yīng)用,DNA測(cè)序就須用LIF,單細(xì)胞和單分子檢測(cè)也離不開(kāi)LIF.LIF不但提高了靈敏度,也可增加選擇性,缺點(diǎn)在于被測(cè)物須用熒光試劑標(biāo)記成染色.利用CE-LIF技術(shù)可檢出染色的單個(gè)DNA分子,向癌癥的早期診斷及臨床酶和免疫學(xué)檢測(cè)等方向進(jìn)行.CE/LIF向三個(gè)方向發(fā)展:在原有氦—鎘激光器(325nm)和氬離子激光器(488nm)之外,發(fā)展價(jià)廉,長(zhǎng)波長(zhǎng)的二極管激光器;發(fā)展更多的熒光標(biāo)記試劑來(lái)擴(kuò)展應(yīng)用面;開(kāi)展更多的應(yīng)用研究.CE/I'IF和微透析結(jié)合可測(cè)定腦中神經(jīng)肽.采用波長(zhǎng)分辨熒光檢測(cè)器可提供有關(guān)蛋白和DNA序列的一些結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)信息[27].一些適用于二極管激光器的熒光標(biāo)記試劑如CY—5等,正在不斷開(kāi)發(fā)和應(yīng)用.
3. CE/MS聯(lián)用
    將現(xiàn)在最有力的分離手段CE和能提供組分結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜聯(lián)用,彌補(bǔ)了CE定性鑒定的不足,故發(fā)展特別快.CE/MS聯(lián)用主要在兩方面發(fā)展:一是各種CE模式和MS聯(lián)用,二是CE和各種MS聯(lián)用.關(guān)鍵是解決接口裝置.成功地應(yīng)用到CE/MS接口中.