凋亡細(xì)胞核DNA片段檢測方法進(jìn)展
摘 要：當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域的研究一個(gè)熱點(diǎn)之一是細(xì)胞凋亡。開展對(duì)細(xì)胞凋亡的研究，首先要解決是方法學(xué)問題。作者從凋亡細(xì)胞的特征性核DNA片段檢測著手，闡述了多種凋亡細(xì)胞核DNA片段檢測方法以及近年來的一些新進(jìn)展。
細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱細(xì)胞凋謝或稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD），是有別于細(xì)胞壞死而受基因控制的一種主動(dòng)性細(xì)胞自殺過程。對(duì)細(xì)胞凋亡的研究已成為當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。開展對(duì)細(xì)胞凋亡的研究，首先要解決的是方法學(xué)問題。根據(jù)凋亡細(xì)胞的生化特征檢測組織或培養(yǎng)細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡發(fā)生狀況，是一種特異而敏感的方法，特別是與其他方法（如流式細(xì)胞儀）結(jié)合后，可以對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定性和定量的研究。下面根據(jù)生化特征檢測細(xì)胞凋亡的方法學(xué)及有關(guān)進(jìn)展作一綜述。
1 瓊脂糖凝膠電泳
細(xì)胞凋亡最顯著而具特征性的生化特征是DNA降解為大約由180～200 bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段，瓊脂糖凝膠電泳可見特征性的“梯狀（Ladder）”帶。有些類型的細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)DNA并不降解成寡核小體片段[1]，有證據(jù)表明[1,2]：凋亡細(xì)胞的DNA降解，早先可產(chǎn)生一些DNA大片段，可以是30～50、200～300、700 kb或更大，隨后再降解成180～200 bp的寡核小體片段或不出現(xiàn)這一步[3]。根據(jù)上述細(xì)胞凋亡的生化特點(diǎn)，列舉幾種常見的瓊脂糖凝膠電泳方法。
1.1 常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳
1.1.1 經(jīng)典的瓊脂糖凝膠電泳[3] 該方法主要用蛋白酶K消化和酚、氯仿，異戊醇抽提去蛋白，無水乙醇和乙酸鈉沉淀DNA，然后行瓊脂糖凝膠電泳。該方法提取的DNA純度高。缺點(diǎn)是過程較復(fù)雜，所需時(shí)間較長，小片段DNA易丟失，且實(shí)驗(yàn)人員需與酚、氯仿等有毒物質(zhì)接觸。
1.1.2 簡易的DNA提取方法[4,5] 有許多種提取凋亡細(xì)胞核DNA的方法，如乙醇固定、磷酸-枸櫞酸（PC）緩沖液提取法，TritonX-100低滲處理細(xì)胞DNA小片段提取法等。這些方法的特點(diǎn)是方法簡便、快速；選擇性提取小片段DNA，因而敏感性較高；無需與酚、氯仿等毒性試劑接觸。
1.2 [6]反轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（Field inversion gel elec-trophoresis，F(xiàn)IGE）由于細(xì)胞凋亡的某一階段可產(chǎn)生大片段DNA，用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳是檢測不出來的，這時(shí)得用FIGE技術(shù)，F(xiàn)IGE對(duì)只產(chǎn)生大片段DNA而沒有寡核小體片段產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡特別有用，結(jié)合形態(tài)學(xué)改變，可檢測較早期的細(xì)胞凋亡。
1.3 彗星鑒定（Comet assay）[7] 彗星鑒定又稱單細(xì)胞凝膠電泳鑒定（Single cell gel assay）或微凝膠電泳（Microgel electrophoresis）。由于電泳的結(jié)果很象彗星，故名“彗星鑒定”。主要用于檢測少量單個(gè)細(xì)胞（Individual cells）DNA損傷的程度。主要分為兩大類：中性彗星鑒定和堿性彗星鑒定，分別檢測雙鏈和單鏈DNA片段。彗星的形成是因?yàn)橛袚p傷的DNA在電泳中從細(xì)胞核中釋放出來發(fā)生遷移，有多種方法估計(jì)和定量彗星形成的類型。一種常用而準(zhǔn)確的方法是分析一種稱之為tail moment的終點(diǎn)（endpoint）現(xiàn)象，包括了尾長（Tail length）和尾部中總DNA的部分。分析tail moment可同時(shí)得知最小的發(fā)生了遷移的DNA（反映在彗星尾的長度）和被釋放或斷裂的DNA片段（通過尾部DNA的熒光強(qiáng)度反映出來）。
彗星鑒定可用于檢測凋亡細(xì)胞寡核小體片段，在中性和堿性彗星鑒定中其終點(diǎn)現(xiàn)象都很明顯。在標(biāo)準(zhǔn)的堿性彗星鑒定中，凋亡細(xì)胞DNA片段遷移的長度是沒受損傷細(xì)胞的幾倍。彗星鑒定檢測DNA斷鏈極為敏感，有人認(rèn)為比流式細(xì)胞儀方法還能更早地檢測出凋亡細(xì)胞。特別適用于少數(shù)甚至單個(gè)細(xì)胞的檢測。
1.4 瓊脂糖凝膠電泳的定量檢測常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡細(xì)胞中的寡核小體片段的缺點(diǎn)是敏感性不高，且不能定量。有學(xué)者[8]在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的基礎(chǔ)上，將放射性同位素P32標(biāo)記寡核小體片段的5’末端，在X光片上放射自顯影成像，并用特定的設(shè)備分析計(jì)算進(jìn)行定量研究。該方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度極高，是常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的1000～2000倍，能檢測出極微量的寡核小體片段（pg級(jí)），且能進(jìn)行定量。但因需與放射性同位素接觸，又需要一定的專門設(shè)備，從而其應(yīng)用受到限制。
2 原位末端標(biāo)記（in situ end-labeling，ISEL）技術(shù)
原位末端標(biāo)記是將摻入到凋亡細(xì)胞中的外源性核苷酸在某種酶的催化下與凋亡細(xì)胞中的單股或雙股斷鏈相結(jié)合，并通過一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。通常有兩種方法，一是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記，簡稱TUNEL鑒定；二是DNA聚合酶I或Klenow大片段介導(dǎo)的原位缺口翻譯，簡稱ISNT鑒定。在不考慮所使用的酶時(shí)，統(tǒng)稱為原位末端標(biāo)記（in situ end-labeling，ISEL）[9,10]。這兩種方法用于檢測組織或培養(yǎng)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的核斷裂片段，可以檢測早期的細(xì)胞凋亡[10]，且特異性和敏感性都是較高的。特別是近年來，通過在方法學(xué)上的不斷改進(jìn)，其敏感性有了很大的提高。就其敏感性而言，TUNEL鑒定高于ISNT鑒定[10,11]。根據(jù)標(biāo)記在dUTP上的標(biāo)記物和顯示系統(tǒng)的不同，可分別作組織切片凋亡細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞涂片的原位檢測及培養(yǎng)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測。
2.1 ISNT（in situ nick translation）[12,13，14,15] ISNT鑒定的基本原理是基于細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生DNA斷鏈，斷鏈有一粘性末端，一條含有游離的3''羥基末端，另一條有伸出的5''末端。利用Klenow大片段的5''-3''聚合酶活性，可將外源摻入的生物素-dUTP從3''羥基末端起始經(jīng)5''-3''方向連接在斷端上，通過帶有辣根過氧化物酶的卵白素（avidin）與之結(jié)合，經(jīng)DAB顯色，便可觀察到細(xì)胞是否存在有核苷酸摻入的DNA斷端。該方法主要用于組織切片的原位檢測，也可用于細(xì)胞涂片的檢測。對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理是必要的，可以提高該方法的敏感性和消除假陽性及非特異性染色
2.2 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling，） TUNEL鑒定的原理與ISNT鑒定相似，所需試劑也與ISNT鑒定相似，不同的是介導(dǎo)的酶是TdT，無需dATP、dCTP、dGTP。用于組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞的檢測，其敏感性較ISNT要高。近年來，該方法經(jīng)過眾多的學(xué)者的改進(jìn)，其特異性特別是敏感性方面有很大的提高。就提高敏感性而言，組織切片和細(xì)胞的預(yù)處理是很重要的。Negoescu等[9]比較了幾種固定劑（包括甲醛、多聚甲醛、丙酮、B5、Bouin’s固定液和甲醇）和預(yù)處理方法（包括去垢劑、蛋白酶和微波爐處理）對(duì)敏感性的影響，結(jié)果顯示：在沒有作預(yù)處理時(shí)，TUNEL鑒定的敏感性很差，只有3%～17%的具有凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞被標(biāo)記上；在使用了預(yù)處理方法后，無論何種固定劑，其敏感性都有所提高。比較了去垢劑（如Triton）、蛋白酶、蛋白酶結(jié)合微波爐和單獨(dú)微波爐預(yù)處理組織和細(xì)胞，以單獨(dú)微波爐處理的效果最好。可將敏感性提高4～30倍，特異性沒有多大的改變。
2.3 凋亡細(xì)胞的TUNEL和ISNT鑒定的流式細(xì)胞儀分析[16]對(duì)于培養(yǎng)的細(xì)胞，可以將TUNEL或ISNT鑒定同流式細(xì)胞儀結(jié)合起來分析其發(fā)生凋亡的情況。待檢細(xì)胞與含有TdT或DNA聚合酶I或Klenow片段及生物素標(biāo)記的dUTP反應(yīng)液共孵育一段時(shí)間后，加入熒光素（常用FITC）標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin），使之特異性地與掛在DNA斷鏈上的生物素結(jié)合，然后在流式細(xì)胞儀上分析熒光強(qiáng)度，可結(jié)合其他的熒光染色方法（如PI染色和熒光免疫表型鑒定）行多參數(shù)的流式細(xì)胞儀分析，使之有很廣的應(yīng)用價(jià)值。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)有：可根據(jù)熒光強(qiáng)度對(duì)凋亡細(xì)胞作出定量分析；可以區(qū)別凋亡和壞死；結(jié)合表型鑒定，確定不同來源的細(xì)胞群中某一或幾種細(xì)胞亞群的凋亡；其檢測與凋亡相關(guān)的DNA降解片段的特異性和敏感性比瓊脂糖凝膠電泳高得多，能檢測出少于（2～5）×103個(gè)細(xì)胞的DNA斷鏈。
3 細(xì)胞凋亡的ELISA檢測[17]
細(xì)胞凋亡ELISA檢測就是基于酶聯(lián)免疫吸附夾心法測定原理，用單克隆抗DNA抗體和抗組蛋白抗體直接檢測DNA和組蛋白，可特異性定量檢測細(xì)胞溶解物細(xì)胞漿成分中的單和寡核苷酸小體。其優(yōu)點(diǎn)有：無需使用放射性同位素；可對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量檢測；抗組蛋白抗體無物種的特異性，可用于各種物種的細(xì)胞凋亡的檢測；高敏感性，較少的細(xì)胞就可獲得結(jié)果。
4 結(jié)語
瓊脂糖凝膠電泳簡單、方便，出現(xiàn)“梯狀”帶雖能證實(shí)凋亡，但只能定性不能定量，不是隨時(shí)電泳都能得到“梯狀”帶，因而敏感性不高，且這種方法一般只用于培養(yǎng)的細(xì)胞，而組織的異源性不能保證該方法的特異性；其他一些電泳方法如反轉(zhuǎn)電場凝膠電泳和彗星鑒定也有其自身的應(yīng)用條件，針對(duì)性較強(qiáng)。原位末端標(biāo)記法的出現(xiàn)，是細(xì)胞凋亡方法學(xué)上的一大進(jìn)步，特別是經(jīng)眾多學(xué)者的應(yīng)用和完善，其特異性尤其是敏感性方面有了很大的提高，廣泛應(yīng)用于各種組織、細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡的研究，特別是結(jié)合抗原免疫表型鑒定和流式細(xì)胞儀分析，可以區(qū)分不同來源的組織或細(xì)胞中的某種或幾種細(xì)胞亞群的凋亡，并進(jìn)行定量研究。正如上面所說，該方法的特異性有一定的限度，就其技術(shù)本身而言，并不能區(qū)別凋亡、壞死和自溶性死亡，必須結(jié)合凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征加以判斷。因此，在細(xì)胞凋亡的研究中，多種方法的結(jié)合是必要的，也是必須的。
作者簡介：譚曉華,男,1962年出生,博士,主治醫(yī)師作者單位：姜泊 張亞歷 周殿元 (第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科研究所，廣州，510515)
譚曉華 (北京軍區(qū)總醫(yī)院肝病研究所)
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細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱細(xì)胞凋謝或稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD），是有別于細(xì)胞壞死而受基因控制的一種主動(dòng)性細(xì)胞自殺過程。對(duì)細(xì)胞凋亡的研究已成為當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。開展對(duì)細(xì)胞凋亡的研究，首先要解決的是方法學(xué)問題。根據(jù)凋亡細(xì)胞的生化特征檢測組織或培養(yǎng)細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡發(fā)生狀況，是一種特異而敏感的方法，特別是與其他方法（如流式細(xì)胞儀）結(jié)合后，可以對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定性和定量的研究。下面根據(jù)生化特征檢測細(xì)胞凋亡的方法學(xué)及有關(guān)進(jìn)展作一綜述。
1 瓊脂糖凝膠電泳
細(xì)胞凋亡最顯著而具特征性的生化特征是DNA降解為大約由180～200 bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段，瓊脂糖凝膠電泳可見特征性的“梯狀（Ladder）”帶。有些類型的細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)DNA并不降解成寡核小體片段[1]，有證據(jù)表明[1,2]：凋亡細(xì)胞的DNA降解，早先可產(chǎn)生一些DNA大片段，可以是30～50、200～300、700 kb或更大，隨后再降解成180～200 bp的寡核小體片段或不出現(xiàn)這一步[3]。根據(jù)上述細(xì)胞凋亡的生化特點(diǎn)，列舉幾種常見的瓊脂糖凝膠電泳方法。
1.1 常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳
1.1.1 經(jīng)典的瓊脂糖凝膠電泳[3] 該方法主要用蛋白酶K消化和酚、氯仿，異戊醇抽提去蛋白，無水乙醇和乙酸鈉沉淀DNA，然后行瓊脂糖凝膠電泳。該方法提取的DNA純度高。缺點(diǎn)是過程較復(fù)雜，所需時(shí)間較長，小片段DNA易丟失，且實(shí)驗(yàn)人員需與酚、氯仿等有毒物質(zhì)接觸。
1.1.2 簡易的DNA提取方法[4,5] 有許多種提取凋亡細(xì)胞核DNA的方法，如乙醇固定、磷酸-枸櫞酸（PC）緩沖液提取法，TritonX-100低滲處理細(xì)胞DNA小片段提取法等。這些方法的特點(diǎn)是方法簡便、快速；選擇性提取小片段DNA，因而敏感性較高；無需與酚、氯仿等毒性試劑接觸。
1.2 [6]反轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（Field inversion gel elec-trophoresis，F(xiàn)IGE）由于細(xì)胞凋亡的某一階段可產(chǎn)生大片段DNA，用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳是檢測不出來的，這時(shí)得用FIGE技術(shù)，F(xiàn)IGE對(duì)只產(chǎn)生大片段DNA而沒有寡核小體片段產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡特別有用，結(jié)合形態(tài)學(xué)改變，可檢測較早期的細(xì)胞凋亡。
1.3 彗星鑒定（Comet assay）[7] 彗星鑒定又稱單細(xì)胞凝膠電泳鑒定（Single cell gel assay）或微凝膠電泳（Microgel electrophoresis）。由于電泳的結(jié)果很象彗星，故名“彗星鑒定”。主要用于檢測少量單個(gè)細(xì)胞（Individual cells）DNA損傷的程度。主要分為兩大類：中性彗星鑒定和堿性彗星鑒定，分別檢測雙鏈和單鏈DNA片段。彗星的形成是因?yàn)橛袚p傷的DNA在電泳中從細(xì)胞核中釋放出來發(fā)生遷移，有多種方法估計(jì)和定量彗星形成的類型。一種常用而準(zhǔn)確的方法是分析一種稱之為tail moment的終點(diǎn)（endpoint）現(xiàn)象，包括了尾長（Tail length）和尾部中總DNA的部分。分析tail moment可同時(shí)得知最小的發(fā)生了遷移的DNA（反映在彗星尾的長度）和被釋放或斷裂的DNA片段（通過尾部DNA的熒光強(qiáng)度反映出來）。
彗星鑒定可用于檢測凋亡細(xì)胞寡核小體片段，在中性和堿性彗星鑒定中其終點(diǎn)現(xiàn)象都很明顯。在標(biāo)準(zhǔn)的堿性彗星鑒定中，凋亡細(xì)胞DNA片段遷移的長度是沒受損傷細(xì)胞的幾倍。彗星鑒定檢測DNA斷鏈極為敏感，有人認(rèn)為比流式細(xì)胞儀方法還能更早地檢測出凋亡細(xì)胞。特別適用于少數(shù)甚至單個(gè)細(xì)胞的檢測。
1.4 瓊脂糖凝膠電泳的定量檢測常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡細(xì)胞中的寡核小體片段的缺點(diǎn)是敏感性不高，且不能定量。有學(xué)者[8]在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的基礎(chǔ)上，將放射性同位素P32標(biāo)記寡核小體片段的5’末端，在X光片上放射自顯影成像，并用特定的設(shè)備分析計(jì)算進(jìn)行定量研究。該方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度極高，是常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的1000～2000倍，能檢測出極微量的寡核小體片段（pg級(jí)），且能進(jìn)行定量。但因需與放射性同位素接觸，又需要一定的專門設(shè)備，從而其應(yīng)用受到限制。
2 原位末端標(biāo)記（in situ end-labeling，ISEL）技術(shù)
原位末端標(biāo)記是將摻入到凋亡細(xì)胞中的外源性核苷酸在某種酶的催化下與凋亡細(xì)胞中的單股或雙股斷鏈相結(jié)合，并通過一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。通常有兩種方法，一是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記，簡稱TUNEL鑒定；二是DNA聚合酶I或Klenow大片段介導(dǎo)的原位缺口翻譯，簡稱ISNT鑒定。在不考慮所使用的酶時(shí)，統(tǒng)稱為原位末端標(biāo)記（in situ end-labeling，ISEL）[9,10]。這兩種方法用于檢測組織或培養(yǎng)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的核斷裂片段，可以檢測早期的細(xì)胞凋亡[10]，且特異性和敏感性都是較高的。特別是近年來，通過在方法學(xué)上的不斷改進(jìn)，其敏感性有了很大的提高。就其敏感性而言，TUNEL鑒定高于ISNT鑒定[10,11]。根據(jù)標(biāo)記在dUTP上的標(biāo)記物和顯示系統(tǒng)的不同，可分別作組織切片凋亡細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞涂片的原位檢測及培養(yǎng)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測。
2.1 ISNT（in situ nick translation）[12,13，14,15] ISNT鑒定的基本原理是基于細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生DNA斷鏈，斷鏈有一粘性末端，一條含有游離的3''羥基末端，另一條有伸出的5''末端。利用Klenow大片段的5''-3''聚合酶活性，可將外源摻入的生物素-dUTP從3''羥基末端起始經(jīng)5''-3''方向連接在斷端上，通過帶有辣根過氧化物酶的卵白素（avidin）與之結(jié)合，經(jīng)DAB顯色，便可觀察到細(xì)胞是否存在有核苷酸摻入的DNA斷端。該方法主要用于組織切片的原位檢測，也可用于細(xì)胞涂片的檢測。對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理是必要的，可以提高該方法的敏感性和消除假陽性及非特異性染色
2.2 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling，） TUNEL鑒定的原理與ISNT鑒定相似，所需試劑也與ISNT鑒定相似，不同的是介導(dǎo)的酶是TdT，無需dATP、dCTP、dGTP。用于組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞的檢測，其敏感性較ISNT要高。近年來，該方法經(jīng)過眾多的學(xué)者的改進(jìn)，其特異性特別是敏感性方面有很大的提高。就提高敏感性而言，組織切片和細(xì)胞的預(yù)處理是很重要的。Negoescu等[9]比較了幾種固定劑（包括甲醛、多聚甲醛、丙酮、B5、Bouin’s固定液和甲醇）和預(yù)處理方法（包括去垢劑、蛋白酶和微波爐處理）對(duì)敏感性的影響，結(jié)果顯示：在沒有作預(yù)處理時(shí)，TUNEL鑒定的敏感性很差，只有3%～17%的具有凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞被標(biāo)記上；在使用了預(yù)處理方法后，無論何種固定劑，其敏感性都有所提高。比較了去垢劑（如Triton）、蛋白酶、蛋白酶結(jié)合微波爐和單獨(dú)微波爐預(yù)處理組織和細(xì)胞，以單獨(dú)微波爐處理的效果最好。可將敏感性提高4～30倍，特異性沒有多大的改變。
2.3 凋亡細(xì)胞的TUNEL和ISNT鑒定的流式細(xì)胞儀分析[16]對(duì)于培養(yǎng)的細(xì)胞，可以將TUNEL或ISNT鑒定同流式細(xì)胞儀結(jié)合起來分析其發(fā)生凋亡的情況。待檢細(xì)胞與含有TdT或DNA聚合酶I或Klenow片段及生物素標(biāo)記的dUTP反應(yīng)液共孵育一段時(shí)間后，加入熒光素（常用FITC）標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin），使之特異性地與掛在DNA斷鏈上的生物素結(jié)合，然后在流式細(xì)胞儀上分析熒光強(qiáng)度，可結(jié)合其他的熒光染色方法（如PI染色和熒光免疫表型鑒定）行多參數(shù)的流式細(xì)胞儀分析，使之有很廣的應(yīng)用價(jià)值。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)有：可根據(jù)熒光強(qiáng)度對(duì)凋亡細(xì)胞作出定量分析；可以區(qū)別凋亡和壞死；結(jié)合表型鑒定，確定不同來源的細(xì)胞群中某一或幾種細(xì)胞亞群的凋亡；其檢測與凋亡相關(guān)的DNA降解片段的特異性和敏感性比瓊脂糖凝膠電泳高得多，能檢測出少于（2～5）×103個(gè)細(xì)胞的DNA斷鏈。
3 細(xì)胞凋亡的ELISA檢測[17]
細(xì)胞凋亡ELISA檢測就是基于酶聯(lián)免疫吸附夾心法測定原理，用單克隆抗DNA抗體和抗組蛋白抗體直接檢測DNA和組蛋白，可特異性定量檢測細(xì)胞溶解物細(xì)胞漿成分中的單和寡核苷酸小體。其優(yōu)點(diǎn)有：無需使用放射性同位素；可對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量檢測；抗組蛋白抗體無物種的特異性，可用于各種物種的細(xì)胞凋亡的檢測；高敏感性，較少的細(xì)胞就可獲得結(jié)果。
4 結(jié)語
瓊脂糖凝膠電泳簡單、方便，出現(xiàn)“梯狀”帶雖能證實(shí)凋亡，但只能定性不能定量，不是隨時(shí)電泳都能得到“梯狀”帶，因而敏感性不高，且這種方法一般只用于培養(yǎng)的細(xì)胞，而組織的異源性不能保證該方法的特異性；其他一些電泳方法如反轉(zhuǎn)電場凝膠電泳和彗星鑒定也有其自身的應(yīng)用條件，針對(duì)性較強(qiáng)。原位末端標(biāo)記法的出現(xiàn)，是細(xì)胞凋亡方法學(xué)上的一大進(jìn)步，特別是經(jīng)眾多學(xué)者的應(yīng)用和完善，其特異性尤其是敏感性方面有了很大的提高，廣泛應(yīng)用于各種組織、細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡的研究，特別是結(jié)合抗原免疫表型鑒定和流式細(xì)胞儀分析，可以區(qū)分不同來源的組織或細(xì)胞中的某種或幾種細(xì)胞亞群的凋亡，并進(jìn)行定量研究。正如上面所說，該方法的特異性有一定的限度，就其技術(shù)本身而言，并不能區(qū)別凋亡、壞死和自溶性死亡，必須結(jié)合凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征加以判斷。因此，在細(xì)胞凋亡的研究中，多種方法的結(jié)合是必要的，也是必須的。
作者簡介：譚曉華,男,1962年出生,博士,主治醫(yī)師作者單位：姜泊 張亞歷 周殿元 (第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科研究所，廣州，510515)
譚曉華 (北京軍區(qū)總醫(yī)院肝病研究所)
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