BIACORE3000操作手冊(cè)
本手冊(cè)包括BIACORE3000工作原理，實(shí)驗(yàn)步驟，操作規(guī)程，注意事項(xiàng)等。

BIA是基于表面等離子體共振（SPR）技術(shù)來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標(biāo)記物的技術(shù)。表面等離子體子共振(surface plasmon resonance , SPR)是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。在發(fā)生全反射的界面涂上一薄層金膜（或其它金屬膜）約50nm厚，由于金膜中有自由電子，它們并不是靜止不動(dòng)而是不停在平衡位置附近振動(dòng)，并具有一定的頻率。當(dāng)光由另一側(cè)以大于臨界角入射有金膜的界面，由于入射光會(huì)在界面方向有一分量，當(dāng)這一分量與金膜中電子振蕩頻率相同時(shí)，兩種能量會(huì)發(fā)生整合，使在某個(gè)角度上發(fā)射光能量降低，這個(gè)能量降低的角度成為SPR角。當(dāng)緊靠在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率不同時(shí),SPR角的位置將不同，根據(jù)SPR角的變化可以推斷所發(fā)生的變化。

BIA是英語(yǔ)“Biomolecular Interaction Analysis”的縮寫，BIA提供了實(shí)時(shí)觀察生物分子間相互作用的技術(shù)。通過(guò)它能觀察兩種分子結(jié)合的特異性，能知道兩種分子的結(jié)合有多強(qiáng)，還能了解生物分子的結(jié)合過(guò)程共有多少個(gè)協(xié)同者和參與者。BIA可以讓得到用其他技術(shù)方法難以得到的結(jié)果，因?yàn)樗�可以�?shí)時(shí)反映分子結(jié)合過(guò)程中每一秒變化的情況。無(wú)需借助標(biāo)記物進(jìn)行分析使BIA廣泛應(yīng)用于各類生物體系的測(cè)定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞。BIA就是利用金屬薄膜表面的折射率的改變，引起共振角的變化，來(lái)推斷金屬薄膜表面的變化。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用的分子溶于溶液流過(guò)芯片表面。檢測(cè)器能跟蹤檢測(cè)溶液中的分子與芯片表面分子的結(jié)合、解離整個(gè)過(guò)程的變化。

BIA技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域主要有四個(gè)方面：
1、動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定2、測(cè)定樣品濃度3、分析相互作用模式4、復(fù)合物功能分析

一、 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合在芯片表面分子質(zhì)量的變化，可以得到兩個(gè)分子之間的結(jié)合與解離常數(shù)。由于檢測(cè)的是芯片表面質(zhì)量的變化，所以大分子的分析物相互較容易得到較強(qiáng)的信號(hào)，但是對(duì)于小分子的分析物可以通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而進(jìn)行檢測(cè)。BIA可以用來(lái)分析不同抗體與抗原的結(jié)合與解離常數(shù)，相對(duì)與以前其它檢測(cè)抗體效價(jià)的方法，BIA不僅快速，可以準(zhǔn)確定量，和可以讓你看到整個(gè)結(jié)合和解離的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

二、濃度的測(cè)量如果簡(jiǎn)單地測(cè)量一個(gè)純物質(zhì)的濃度，有很多方法可以選擇。但是如果想知道，某種復(fù)合物中其中一個(gè)組分的濃度，則很難實(shí)現(xiàn)。用BIA技術(shù)可以很輕松做到這一點(diǎn)。先將待測(cè)物的抗體耦聯(lián)到芯片表面，再將一系列不同濃度的標(biāo)樣流過(guò)芯片，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，此時(shí)將混合物流過(guò)芯片，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度大小就可以得到原混合物中某組分的濃度。如果待測(cè)物很小，可以采取競(jìng)爭(zhēng)的方法實(shí)現(xiàn)。

三、分子相互作用模式的研究我們想知道兩分子之間相互作用的比例，結(jié)合位點(diǎn)，抗原決定族的位點(diǎn)，都可以用BIA來(lái)完成。研究突變后活力大小的變化，研究復(fù)合物形成次序等等。

四、蛋白質(zhì)功能分析復(fù)合物的組裝可以看成研究蛋白功能的一個(gè)例子。也可以設(shè)計(jì)其它的一些實(shí)驗(yàn)，只要前后芯片表面的質(zhì)量有變化就可以利用BIA技術(shù)來(lái)檢測(cè)。

四、實(shí)驗(yàn)步驟
1、 preconcentration （預(yù)結(jié)合試驗(yàn)）
由于芯片表面帶有負(fù)電，因此要偶聯(lián)到芯片上的分子必須帶上正電，才有利于分子吸附到芯片表面，以利于共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)的完成。預(yù)結(jié)合實(shí)驗(yàn)就是將樣品溶解在不同PH值的緩沖液中，使其帶上不同量的電荷。然后，將樣品流過(guò)芯片表面，觀察它與芯片的結(jié)合曲線，就可判斷出合適的條件。如下圖：兩種不同條件下的吸附實(shí)驗(yàn)，第一個(gè)峰表明在該條件下，吸附很快達(dá)到飽和，這樣吸附的量有限，第二種一直呈上升趨勢(shì)，有利于在芯片上偶聯(lián)較多的蛋白。實(shí)際工作中，還會(huì)碰到各種不同的吸附曲線，需要根據(jù)實(shí)際情況來(lái)判斷最佳條件。 將抗體用不同PH值得buffer稀釋10－40倍，以5μl/min的流速流過(guò)芯片表面，觀察抗體與芯片的吸附結(jié)果。

2、 偶聯(lián)
a) 取100μlNHS和100微升EDC混合，12000rpm離心5分鐘；
b) 取一定體積的偶聯(lián)蛋白，按預(yù)結(jié)合的比例稀釋，稀釋后需要150μl，取100μl ethanolamineHCL。以上試劑平衡到室溫25攝氏度左右，高速離心五分鐘；
c) 將上述三種試劑放在樣品架上，設(shè)定加樣流速為10μl/min，inject方式進(jìn)樣，NHS/EDC,樣品，ethanolamine-HCl分別上樣100，100，和60μl。
d)結(jié)束即可得到類似下圖的曲線。

3、 結(jié)合
將抗原用合適的緩沖液稀釋成適當(dāng)濃度，離心后上樣，觀察抗原抗體結(jié)合過(guò)程。
如果需要測(cè)量不同條件下的結(jié)合狀況，可以在一次進(jìn)樣結(jié)束之后，對(duì)芯片進(jìn)行再生。然后再上下一個(gè)樣品。
4、 芯片再生
抗原抗體結(jié)合的再生條件比較簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)單地用PH2.5的10mMglycine沖洗就可以了。但實(shí)際工作中，如果偶聯(lián)的是蛋白，往往情況要復(fù)雜得多。首先,再生條件要能將結(jié)合物從芯片上去掉，其次不能讓結(jié)合在芯片上的蛋白變性失活。因?yàn)�，萬(wàn)一所選條件使芯片上偶聯(lián)的蛋白失活，這個(gè)通道就意味著報(bào)廢。所以，芯片的再生是所有用戶面臨的一個(gè)比較頭疼的問(wèn)題。芯片再生要求再生之后，不僅要求基線要能回復(fù)到初始值，還要求再上相同的樣品，結(jié)合能力不會(huì)出現(xiàn)明顯下降。

5、 如果需要得到結(jié)合與解離的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，至少需要進(jìn)行五組不同濃度的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

6、 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，打印實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

7、 儀器維護(hù)，實(shí)驗(yàn)完畢，running
buffer換成過(guò)濾并脫氣的超純水或HES－EP緩沖液。芯片更換為維護(hù)芯片，進(jìn)行至少兩遍prime后，運(yùn)行standby。

8、 收拾整理實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所。

附錄
BIAcore 3000生物分子相互作用分析儀
BIAcore系統(tǒng)的3個(gè)核心部分是傳感器芯片，SPR光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，微射流卡盤。

傳感器芯片
傳感器芯片是實(shí)時(shí)信號(hào)的傳導(dǎo)載體。芯片是在玻璃片上覆蓋了一層金膜，在金膜的表面連有不同的多聚物以形成不同的表面環(huán)境，以利于固定不同性質(zhì)的生物分子。每個(gè)芯片表面有4個(gè)通道（FC），可以獨(dú)立做4個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)，也可以做實(shí)時(shí)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

SPR光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)
BIA技術(shù)是基于一種表面等離子共振（SPR）的物理光學(xué)現(xiàn)象的生物傳感分析技術(shù)。不必使用熒光標(biāo)記和同位素標(biāo)記，從而保持了生物分子的天然活性。當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同透明介質(zhì)的界面時(shí)將產(chǎn)生全反射，且反射光強(qiáng)度在各個(gè)角度上都應(yīng)相同，但若在介質(zhì)表面鍍上一層金屬薄膜后，由于入射光可以引起金屬中自由電子的共振，從而導(dǎo)致反射光在一定的角度內(nèi)大大減弱，其中使反射光完全消失的角度稱為共振角。共振角會(huì)隨金屬薄膜表面通過(guò)的液相的折射率的改變而改變，折射率的變化（RU）又和結(jié)合在金屬表面的大分子質(zhì)量稱正比。因此，BIA技術(shù)可以通過(guò)對(duì)反應(yīng)全過(guò)程中各種分子反射光的吸收獲得初始的數(shù)據(jù)，并經(jīng)相關(guān)處理獲得結(jié)果－傳感圖。

微射流卡盤
微射流卡盤是一個(gè)液體傳送系統(tǒng)，通過(guò)軟件的控制自動(dòng)地傳送一定體積的樣品至傳感器芯片表面的不同通道。甚至自動(dòng)進(jìn)行樣品的回收。
今天對(duì)生命科學(xué)奧秘的探索，已經(jīng)不僅僅停留在是什么，而是要探詢?yōu)槭裁�。旨在揭示生命現(xiàn)象背后的機(jī)理研究，必然要理清生物分子間復(fù)雜的關(guān)系。只有Biacore能實(shí)時(shí)反映生物分子相互作用的整個(gè)過(guò)程，而不同于其他只能提供生物分子作用后的結(jié)果的方法，為您開辟一個(gè)嶄新的研究角度。

BIA目前應(yīng)用的領(lǐng)域有：
- 蛋白質(zhì)組學(xué)研究（Proteomics）
- 癌癥研究 (Cancer Research)
- 新藥研發(fā) (Drug Discovery)
- 信號(hào)傳遞 (Cell Signalling)
- 多分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和組裝 ( Multi-molecular Complexes)
- 分子識(shí)別（Molecular Recognition）
- 免疫調(diào)節(jié) (Immune Regulation)
- 免疫測(cè)定法 （Immunoassay）
- 疫苗開發(fā) （Vaccine Development）
- 瞬時(shí)結(jié)合（Transient Binding）
- 配體垂釣 (Ligand Fishing)
- 結(jié)合特異性 （Binding Specificity）
- 結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （Structure-function Relationship）
- 酶反應(yīng)（Enzyme Reaction）

樣品類型
小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、寡聚糖、類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞

操作流程
一、樣品準(zhǔn)備
樣品包括耦聯(lián)到芯片表面的分子（ligand）和在溶液中流過(guò)的樣品，稱作analyte。如果ligand是小分子，要檢查該分子結(jié)構(gòu)上是否有可供耦聯(lián)的俄基團(tuán)，如果沒有需要考慮對(duì)分子進(jìn)行修飾。
二、緩沖液準(zhǔn)備
該實(shí)驗(yàn)要求所有緩沖液都經(jīng)過(guò)過(guò)濾和脫氣處理。如果緩沖液能夠耐受高溫的話，可以對(duì)緩沖液進(jìn)行滅菌處理。這樣滅菌有脫氣的效果，同時(shí)也能保存更長(zhǎng)的時(shí)間。
三、耦聯(lián) 參照耦聯(lián)的具體方法。
四、測(cè)試 將分析物用合適的緩沖液稀釋處理，上樣。要盡可能讓樣品緩沖液與系統(tǒng)載流緩沖液一致，
五、再生 再生是指將結(jié)合到芯片表面的分析物洗脫掉，以便芯片的重復(fù)使用。

日常維護(hù)
1、 每周要進(jìn)行一次DESORB
2、 緩沖液要每天檢查，脫氣處理；

來(lái)源：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心