生物大分子相互作用檢測技術(shù)新進展———三色熒光級聯(lián)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)
A Progress in Detection of Interactions Between Macromolecules: Linked FRET Using Three Color Fluorophore

中文摘要：
熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)，是指能量從一種受激發(fā)的熒光基團 (fluorophore)以非輻射的方式轉(zhuǎn)移到另一種熒光基團的物理現(xiàn)象. FRET的能量轉(zhuǎn)移效率是兩個熒光基團間距離的函數(shù)，并對此距離十分敏感，它的有效響應(yīng)距離一般在1～10 nm之間，因而可被用于測定原子間及分子間的距離. 這一特點使FRET技術(shù)在大分子構(gòu)象變化、大分子之間相互作用、細胞信號通路等研究中發(fā)揮重要作用, 成為生物醫(yī)學研究中的重要方法. 但細胞內(nèi)的生物學過程常常涉及多于兩個的大分子間相互作用，二色熒光基團的FRET技術(shù)不能滿足這種生物學研究的需求. 最近，兩個研究小組在這方面取得突破，建立了分別基于共聚焦顯微鏡和流式細胞儀的三色熒光級聯(lián)FRET技術(shù). 這一技術(shù)的出現(xiàn)將會極大地促進生物學及相關(guān)研究領(lǐng)域的發(fā)展.

生物大分子相互作用檢測技術(shù)新進展———三色熒光級聯(lián)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) 《生物化學與生物物理進展》劉春春 劉春春2006,33(3):292-296

查看全文: http://www.pibb.ac.cn/cn/ch/common/create_pdf.aspx?file_no=2005-0818&flag=1

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

一、活細胞研究遇到的問題：
蛋白質(zhì)或其他分子在活細胞內(nèi)互相結(jié)合的時間和地點是了解它們功能的關(guān)鍵問題。要回答這一問題，需將蛋白質(zhì)標上不同的熒光團。但是，光學顯微鏡的分辨率將蛋白質(zhì)檢測精度限制在大約0.2μm左右。要研究蛋白質(zhì)成分的相互物理作用，需要高的分辨率。

二、什么是FRET？
FRET就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（1-10 nm）時，將光子能從一個受激發(fā)的熒光團（供體）轉(zhuǎn)移到另一個熒光團（受體）。 采用FRET，可以解決超過光學顯微鏡分辨率限制的分子相對鄰近度問題，來顯示（例如）（1）二個蛋白質(zhì)成分間分子相互作用；（2）一個分子內(nèi)部（如酶活動能力、DNA/RNA形態(tài)）的結(jié)構(gòu)變化；（3）采用象CFP-YFP Cameleon這樣特別的FRET-工具的離子濃度

三、FRET原理
受激發(fā)后的熒光團（供體）將受激發(fā)的靜能轉(zhuǎn)移到一個光吸收分子（受體）。這種能的轉(zhuǎn)移是非放射性的，其主要原因是供體和受體之間的偶極-偶極間的相互作用。通過雙偶極反應(yīng)，一個處于激發(fā)態(tài)的供體以非激發(fā)方式將能量傳遞給旁邊的受體。 這一理論基于將被激發(fā)熒光分子看成振蕩偶極子，能夠和有同一震蕩頻率的另一個偶極子發(fā)生能量交換。
只有幾個熒光團對才適合FRET實驗，因為，除了其他必要條件（如偶極子定向、足夠的熒光壽命），供體放射光譜必須將受體的激發(fā)光譜重疊起來。已知的FRET對是CFP/YFP、BFP/GFP、GFP/諾丹明、FITC/Cy3。

四、FRET的應(yīng)用
象綠色熒光蛋白質(zhì)（GFP）這樣的熒光蛋白質(zhì)（FPs）對FRET實驗非常有吸引力。它們可以以基因方法被融合到有關(guān)蛋白質(zhì)中去并且用細胞表達，使它們成為基因表達和蛋白質(zhì)在活細胞中本地化的極好報告系統(tǒng)�？梢蕴峁┎煌�光譜特性的增強型FP變異。
用青綠色的CFP作供體、黃色的YFP作受體是最適合做活細胞FRET實驗的，因為CFP放射光譜部分重疊了YFP激發(fā)光譜。當它們足夠接近時，用CFP的吸收波長激發(fā)，CFP的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對空間位置的改變非常靈敏[1-2 ]。例如要研究兩種蛋白質(zhì)a和b間的相互作用，可以根據(jù)FRET原理構(gòu)建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白質(zhì)b、 YFP(yellow fluorescent protein)。用CFP吸收波長433nm作為激發(fā)波長，實驗靈巧設(shè)計，使當?shù)鞍踪|(zhì)a與b沒有發(fā)生相互作用時，CFP與YFP相距很遠不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測到的是CFP的發(fā)射波長為476nm的熒光；但當?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是YFP的發(fā)射波長為527nm的熒光(圖1)。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細胞內(nèi)表達，這樣就可以在活細胞生理條件下研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用。