Human Umbilical Cord-Mesenchymal Stem Cells Promote Extracellular Matrix Remodeling in Microglia

Keywords: extracellular matrix; human umbilical cord mesenchymal stem cells; microglia; migration; neuroinflammation.

小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細胞，是大腦發(fā)育、體內平衡和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關鍵參與者。小膠質細胞具有高度可塑性，并可根據(jù)位置和系統(tǒng)需求獲得各種結構變化和轉錄表型。在可以驅動小膠質細胞走向有益表型的策略中，間充質干細胞（MSCs）是目前正在被研究作為影響成人和新生兒神經(jīng)炎癥性疾病的有吸引力的細胞療法。MSCs調節(jié)多種免疫細胞效應功能并減弱活性氧的產(chǎn)生，促進神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床前模型中腦組織功能的恢復，包括圍產(chǎn)期腦損傷、創(chuàng)傷性腦損傷和神經(jīng)退行性疾病。

具體來說，在TBI小鼠模型中，MSCs的分泌蛋白組在體外和體內誘導促再生小膠質細胞標志物（Ym1和Arg1 mRNAs）的表達，促進其持續(xù)恢復。此外，當與MSCs共培養(yǎng)時，對炎性細胞因子有反應的小膠質細胞會釋放細胞外囊泡（EVs），當注射到脫髓鞘小鼠模型中時，這些EVs會促進髓鞘病變部位的髓鞘修復。然而，MSCs 促進小膠質細胞向穩(wěn)態(tài)/促再生功能轉變的分子機制仍有待完全闡明。

最近，在意大利國家研究委員會神經(jīng)科學研究所、米蘭比可卡大學醫(yī)學與外科系及英國諾丁漢特倫特大學科學與技術學院的一項聯(lián)合研究中，通過使用大量轉錄組學方法，揭示了與人臍帶間充質干細胞（h-MSCs）共培養(yǎng)誘導的活化小膠質細胞信號通路，首次闡釋了細胞外基質（ECM）的重塑；還研究了 h-MSCs 對小膠質細胞在體外響應細胞因子的基本功能的影響，包括增殖、運動、吞噬作用和抗原呈遞。研究成果發(fā)表在 CELLS 期刊題為“Human Umbilical Cord-Mesenchymal Stem Cells Promote Extracellular Matrix Remodeling in Microglia”。

為了表征 h-MSCs 對活化小膠質細胞（TNFα+ IFNγ+ IL-1β 刺激）的影響，首先通過 qPCR 量化了保護/免疫調節(jié)基因（Arg1 和 Socs3 mRNAs）、炎癥基因 （Tnfα 、 Ptgs2、Nos2、Il1β 和 Il6 mRNAs）、穩(wěn)態(tài)基因 Tmem119 和疾病相關小膠質細胞（DAM）基因 Clec7a mRNA 的表達。結果表明，在炎癥條件下，單獨培養(yǎng)的小膠質細胞上調了炎癥基因Tnfα、Ptgs2、Nos2、Il6 mRNAs，免疫調節(jié)基因 Socs3 和激活標志物 Clec7a，而與 h-MSCs 共培養(yǎng)的小膠質細胞上調了 Arg1、Socs3 及Tmem119 mRNA 表達，并下調了 Clec7a mRNA。h-MSCs 對小膠質細胞炎癥基因表達的影響很復雜，一些炎癥基因下調，如Tnfα 和 Ptgs2，而其他，如Nos2、Il6 和 Il1β 呈現(xiàn)過表達（圖1）。這些數(shù)據(jù)表明，盡管h-MSCs 維持甚至上調了一些炎癥特征，但在細胞因子的作用下，h-MSCs 誘導了小膠質細胞中保護性標志物的表達并部分抵消了炎癥基因表達。

為了證實這些發(fā)現(xiàn)，在體外小膠質細胞培養(yǎng)物中量化了免疫調節(jié)標志物、炎癥標志物和抗炎標志物的表達。數(shù)據(jù)表明，與從混合培養(yǎng)物中獲得的小膠質細胞相比，h-MSCs 在體外小膠質細胞對炎癥細胞因子的反應中更快、更有效地抑制炎癥基因表達，這與在大腦環(huán)境中缺乏抑制信號的情況下，小膠質細胞在體外存活時間更長的反應性是一致的。

圖1 h-MSCs 影響原代小鼠小膠質細胞中的穩(wěn)態(tài)和活化標志物表達。

為了更深入地了解 h-MSCs 與活化的小膠質細胞共培養(yǎng)誘導的轉錄變化，接下來進行了大量 RNA-seq。在存在或不存在 h-MSCs 的情況下培養(yǎng)的活化小膠質細胞之間的差異基因表達分析顯示，共有 1519 個顯著失調的 mRNAs （711 個上調和 808 個下調）。在被 h-MSCs 高度上調的基因中，發(fā)現(xiàn)了保護/免疫調節(jié)基因 Arg1 和 Socs3，以及 Il1β 和血清淀粉樣蛋白Saa3，這證實了上述通過 qPCR 分析觀察到的結果。此外，還檢測到編碼ECM成分的蛋白及其調節(jié)因子的顯著上調。相反，穩(wěn)態(tài)基因 Cx3cr1 和脂蛋白脂酶（Lpl）mRNA 是下調最多的基因，這一發(fā)現(xiàn)與顯示這些標記物在小膠質細胞激活時下調的研究數(shù)據(jù)一致。

對DEGs通路的進一步分析強調了小膠質細胞在積極修飾 ECM 和影響 ECM 依賴性神經(jīng)元活動（如軸突導向）中的關鍵作用，表明 h-MSCs 處理的小膠質細胞可能參與 ECM 重塑和沉積。基因集富集分析（GSEA）顯示，與活化的小膠質細胞相比，在 h-MSCs 處理的小膠質細胞中有10個基因組富集，表明 h-MSCs 顯著改變了 ECM 基因表達。這些數(shù)據(jù)有力地支持了由小膠質細胞引起的 ECM 變化受 h-MSCs 直接調控的觀點。

其中，最豐富的基因集是 NABA_CORE_MATRISOME，這是編碼核心細胞外基質元件的基因集合，分析顯示，其存在編碼幾種關鍵 ECM 成分的基因的存在，例如膠原蛋白亞型、層粘連蛋白1-2-4、玻連蛋白等。其他上調的 NABA 基因包括轉谷氨酰胺酶 （Tgm1-2-4-6-7），它們通過細胞外交聯(lián)活性在ECM穩(wěn)定和抗降解中發(fā)揮重要作用。總的來說，觀察到的 NABA 基因上調表明 ECM 沉積和穩(wěn)定增加。

通路分析和 GSEA 還揭示了與單獨培養(yǎng)的活化小膠質細胞相比，h-MSCs 處理的小膠質細胞中免疫調節(jié)細胞因子白細胞介素-4 和 -13 以及白細胞介素-10 的富集信號（圖2 A、B）。此外，使用免疫過程負調控特異性基因集的進一步 GSEA 證實了參與免疫調節(jié)途徑的基因的富集（圖2 B），這與 h-MSCs 對小膠質細胞炎癥反應的復雜作用一致（圖1）。對關鍵小膠質細胞功能特異性基因集的 GSEA 證實了控制細胞周期的基因下調（圖2 C），抗原呈遞相關基因的下調（圖2 C），但參與吞噬作用的基因表達無變化。相反，與單獨培養(yǎng)的活化小膠質細胞相比，hMSCs 處理的小膠質細胞中與黏著斑、趨化因子活性、髓樣細胞遷移和運動相關的基因顯著富集（圖2 C），表明 h-MSCs 處理提高了小膠質細胞在環(huán)境中的監(jiān)測能力。

這些數(shù)據(jù)表明，增殖、抗原呈遞和運動/遷移是受 h-MSCs 影響的關鍵小膠質細胞功能，此外還有 ECM 重塑和炎癥反應的調節(jié)。

圖2 RNA-seq 分析顯示與 h-MSCs 共培養(yǎng)的小膠質細胞對細胞周期和免疫系統(tǒng)的調節(jié)。

最后，為了探索 h-MSCs 誘導的基因表達變化如何影響小膠質細胞功能，分析單獨培養(yǎng)或與 h-MSCs 一起培養(yǎng)的活化小膠質細胞中ECM 沉積、細胞運動、增殖、吞噬作用和抗原呈遞能力。

免疫熒光分析顯示，與活化的小膠質細胞相比，h-MSCs處理的小膠質細胞及其周圍環(huán)境的ECM成分纖維連接蛋白染色增加（圖3 A、B），細胞外交聯(lián)劑 TG2 的免疫反應性也更強（圖3 C、D），這表明暴露于 h-MSCs 的活化小膠質細胞中，TG2 酶活性和 ECM 重塑/穩(wěn)定增加。

然后監(jiān)測小膠質細胞的運動，分析顯示，與單獨培養(yǎng)的小膠質細胞相比，與 h-MSCs 培養(yǎng)的小膠質細胞的移動路徑更長，速度更快，并且細胞褶皺形成增加（圖3 E、F），這是積極遷移細胞的特征。增殖測定發(fā)現(xiàn)，活化的小膠質細胞中 EdU+ 增殖的小膠質細胞的百分比強烈降低，這與之前的研究一致，表明炎癥刺激 LPS 強烈抑制小膠質細胞增殖，但 h-MSCs 培養(yǎng)并沒有進一步降低，排除了 h-MSCs 對該細胞功能的主要影響。對吞噬的定量分析表明，單獨培養(yǎng)或與 h-MSCs 共培養(yǎng)的活化小膠質細胞的吞噬能力與對照細胞的吞噬能力沒有差異。

此外，還評估了主要組織相容性復合物II（MHCII）蛋白（小膠質細胞抗原呈遞能力的指標）和CLEC7a（活化反應小膠質細胞（ARMs）標志物）的表達。結果表明，與單獨培養(yǎng)的對照小膠質細胞相比，對炎性細胞因子有反應的小膠質細胞的 MHCII 和 CLEC7a 免疫反應性增加，表明抗原呈遞能力和細胞活化增強。然而，在與 h-MSCs 共培養(yǎng)的活化小膠質細胞中，MHCII 水平恢復到對照水平，CLEC7a 表達甚至低于對照水平，揭示了 MSCs 分泌蛋白組抑制免疫小膠質細胞功能的能力。

這些數(shù)據(jù)表明，h-MSCs 在炎癥刺激下促進小膠質細胞中的 ECM 沉積和運動，但不會顯著影響這些細胞的增殖和吞噬能力。此外，h-MSCs 可抵消炎性細胞因子誘導的 MHCII 和 CLEC7a 蛋白水平的增加。

圖3 h-MSCs 對細胞外基質組成和小膠質細胞運動的影響。

圖4 在這項研究中，利用 h-MSCs 對非接觸培養(yǎng)物中活化的小膠質細胞進行大量轉錄組學分析，以確定受 h-MSCs 影響的分子途徑并探索它們對小膠質細胞功能的影響，發(fā)現(xiàn) h-MSCs 分泌組改變的最相關途徑與 ECM 重塑有關，導致 ECM 沉積增加和小膠質細胞運動增加。

總之，該研究通過體外共培養(yǎng)方法結合轉錄組學和功能分析，揭示了小膠質細胞中 ECM 重塑和細胞運動是受 h-MSCs 分泌組控制的新功能�？刂� ECM 重塑的轉錄變化可能是促再生小膠質細胞轉化的關鍵，這有助于在神經(jīng)炎癥性疾病的實驗模型中發(fā)揮 h-MSCs 的保護作用，這一假設仍有待在未來的研究中探索。

參考文獻：Lombardo MT, Gabrielli M, Julien-Marsollier F, Faivre V, Le Charpentier T, Bokobza C, D'Aliberti D, Pelizzi N, Halimi C, Spinelli S, Van Steenwinckel J, Verderio EAM, Gressens P, Piazza R, Verderio C. Human Umbilical Cord-Mesenchymal Stem Cells Promote Extracellular Matrix Remodeling in Microglia. Cells. 2024 Oct 9;13(19):1665. doi: 10.3390/cells13191665. PMID: 39404427; PMCID: PMC11475221.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39404427/

Impact Factor: 5.1 (2023); 5-Year Impact Factor: 6.0 (2023)

ISSN: 2073-4409

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