顯微成像技術(shù)現(xiàn)在發(fā)展的越來越成熟，這些先進(jìn)的技術(shù)可以幫助我們?cè)诓煌瑯颖绢愋秃蛨D像應(yīng)用中捕獲到盡可能多的細(xì)節(jié)，提供了強(qiáng)大的助力，然而，隨著研究越來越復(fù)雜，顯微數(shù)字圖像檢測(cè)系統(tǒng)越來越多樣，我們需要對(duì)各種顯微相機(jī)的運(yùn)作方式有基本了解，以便適配并采納最佳解決方案以滿足成像需求。

因此，了解來自樣本的模擬信息是如何被處理成數(shù)字圖像以供存儲(chǔ)和展示這一過程的基本概念對(duì)于顯微鏡操作者來說較為重要。無論是比較要購買的相機(jī)，還是確定實(shí)驗(yàn)室或核心設(shè)施中哪個(gè)現(xiàn)有的顯微鏡最適合研究需求，都必須理解一些基本要素，選配合適的成像系統(tǒng)，來盡可能的獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

圖像捕獲方法：

光學(xué)顯微鏡的數(shù)字成像起點(diǎn)，是感知來自樣本不同區(qū)域的光子數(shù)量（信號(hào)強(qiáng)度）并準(zhǔn)確識(shí)別光子在樣本中的起始位置，其感知到的到達(dá)相機(jī)傳感器的信號(hào)是模擬格式，而相機(jī)必須將該模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為盡可能準(zhǔn)確表示模擬信息的數(shù)字信號(hào)。

對(duì)于數(shù)字成像，有兩種方法獲取模擬信號(hào)強(qiáng)度和位置信息。

第一種是幀圖像捕獲，其中來自目標(biāo)視場(chǎng)的光線同時(shí)投影到傳感器陣列上，陣列中每個(gè)傳感器捕獲來自樣本的一小部分信息，這些信息的陣列組合就形成了我們觀測(cè)視場(chǎng)的中的圖像

這種方式下，相機(jī)同時(shí)捕獲了光子信號(hào)的強(qiáng)度及其在樣本中的位置。（圖1）

圖1

另一種方法是點(diǎn)掃描圖像捕獲——將光聚焦到樣本的一個(gè)小區(qū)域并捕獲來自該小區(qū)域的信號(hào)（圖2）。

在這種方法中，光束通常在樣本上進(jìn)行光柵掃描以順序獲取所需的視場(chǎng)。在這里，傳感器只捕獲了傳入信號(hào)的強(qiáng)度，而其位置信息是從照明光束在樣本上的位置推斷出來的。

圖2

全幀圖像捕獲：

幀圖像捕獲系統(tǒng)的案例有不同類型的電荷耦合器件（CCD）和科學(xué)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（sCMOS）相機(jī)。

不管是CCD還是sCMOS相機(jī)，來自樣本的入射光子擊中光傳感器，其能量被轉(zhuǎn)換為電子（圖2）。

其產(chǎn)生的電子數(shù)量與捕獲的光子信號(hào)強(qiáng)度成正比。然后電子被轉(zhuǎn)換為電壓，由模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器（ADC）讀取并數(shù)字化為代表傳入信號(hào)強(qiáng)度的灰度值。

然而，在超過一定的光子通量（每單位時(shí)間的光子強(qiáng)度）后，傳感器將無法產(chǎn)生額外的電子。

這個(gè)值，就是傳感器的滿阱容量，超過這個(gè)水平，傳感器就被認(rèn)為是飽和的。

為了準(zhǔn)確測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度，信號(hào)必須保持在滿阱容量以下，最理想情況下是將其控制在最小可檢測(cè)信號(hào)和滿阱容量之間。

在這種類型的圖像捕獲中，單個(gè)傳感器的大小決定了圖像中的像素大�。ǚ直媛剩�，傳感器大小必須足夠小，才能捕獲由顯微鏡形成的圖像中最精細(xì)的細(xì)節(jié)。

冷卻CCD是使用傳感器陣列設(shè)計(jì)的兩種技術(shù)中較老的一種。在最簡(jiǎn)易的CCD陣列實(shí)現(xiàn)中，落在每個(gè)傳感器（像素）上的光被轉(zhuǎn)換為電子。在曝光結(jié)束時(shí)，存儲(chǔ)在傳感器中的電子信號(hào)被順序地逐行轉(zhuǎn)移到讀出寄存器，然后逐幀放大并轉(zhuǎn)換為數(shù)字值（圖3）。

圖3

這個(gè)過程需要時(shí)間，從而會(huì)減緩相機(jī)的幀率。

目前已經(jīng)開發(fā)了幾種CCD處理的變體以增加靈敏度。行間冷卻CCD（圖4）是顯微鏡中使用最普遍的CCD類型。

圖4

#在傳統(tǒng)的冷卻CCD相機(jī)中，由獨(dú)立的傳感器收集的電子被順序地一行一行地傳輸?shù)酱�行讀出寄存器中。從讀出寄存器，電荷被逐像素讀取，放大，并數(shù)字化為二進(jìn)制灰度值存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中并隨后顯示。在行間CCD中，電荷首先從單個(gè)傳感器轉(zhuǎn)移到存儲(chǔ)寄存器中，然后從那里逐行讀出。這使得傳感器可以更快地開始收集另一個(gè)圖像。

對(duì)于CCD，像素電荷會(huì)被轉(zhuǎn)移到存儲(chǔ)寄存器中進(jìn)行讀取，而不是在開始新的曝光之前逐個(gè)像素地讀出其值，這樣做釋放了單個(gè)傳感器可以去進(jìn)行新的曝光。雖然這允許更快的周轉(zhuǎn)，但電荷存儲(chǔ)區(qū)域減少了芯片上可用于光收集的區(qū)域。目前大多數(shù)行間CCD使用微透鏡將入射光聚焦到傳感器區(qū)域，這在一定程度上緩解了阻擋光的問題。

盡管CCD在顯微鏡中仍有其用途，但在大多數(shù)應(yīng)用場(chǎng)景下，CCD已被sCMOS系統(tǒng)取代。在CCD陣列中，每個(gè)像素的信息通過一個(gè)輸出節(jié)點(diǎn)、放大器和數(shù)字轉(zhuǎn)換器傳輸，而對(duì)于sCMOS相機(jī)，像素是并行讀取的（圖5）。

圖5

他的每個(gè)傳感器都包含自己的電容器和放大器，每行像素都有自己的ADC。這以更低需求的功率實(shí)現(xiàn)了更快、更高效的讀取。

當(dāng)前sCMOS技術(shù)比CCD有許多優(yōu)勢(shì)，包括更寬的視場(chǎng)、更高的量子效率（QE）、更寬的動(dòng)態(tài)范圍、更快的幀率和更好的功率效率。

另外，CCD和sCMOS的量子效率在所有波長(zhǎng)上都不是均勻的。了解相機(jī)的光譜響應(yīng)對(duì)于數(shù)據(jù)解釋至關(guān)重要，特別是在熒光數(shù)據(jù)中，必須分離來自密切相關(guān)的光的波長(zhǎng)的信號(hào)。

盡管sCMOS相機(jī)相較于CCD有一些優(yōu)勢(shì)，但并不能在所有場(chǎng)景下完全取代。

冷卻CCD比等效的sCMOS系統(tǒng)具有更少的暗電流噪聲，這種噪聲會(huì)在長(zhǎng)時(shí)間曝光下累積，因此對(duì)于需要長(zhǎng)時(shí)間曝光的、信號(hào)非常低的樣本，冷卻CCD將具有更好的信噪比閾值。這些類型的樣本包括生物發(fā)光研究、熒光素酶報(bào)告成像和基于化學(xué)還原的熒光。

像素大小影響傳感器的滿阱容量和相關(guān)的動(dòng)態(tài)范圍。傳感器的動(dòng)態(tài)范圍計(jì)算方式是總滿阱容量除以噪聲水平。因此一個(gè)滿阱容量為6000、噪聲水平為2e-的傳感器,將具有3000:1的動(dòng)態(tài)范圍.從黑到白，它可以區(qū)分3000個(gè)單獨(dú)的光子通量水平，并將它們轉(zhuǎn)換為圖像中的3000個(gè)不同的灰度值；一個(gè)滿阱容量為34000、噪聲水平為2e-的傳感器將具有17000:1的動(dòng)態(tài)范圍，這個(gè)相機(jī)相對(duì)具有更強(qiáng)大的能力，能夠清晰識(shí)別來自樣本不同區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度的更微妙的差異，使圖像具有更高的對(duì)比度分辨率。

點(diǎn)掃描圖像捕獲：

在點(diǎn)掃描圖像捕獲中，樣本被聚焦光束探測(cè)，記錄光束與樣本相互作用的信息。激光掃描熒光共聚焦顯微鏡是光顯微鏡中使用的主要點(diǎn)掃描系統(tǒng)。還有其他掃描熒光技術(shù)，但這些技術(shù)并不廣泛采用。

動(dòng)態(tài)范圍和模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換：

動(dòng)態(tài)范圍是一個(gè)經(jīng)常被忽視的選擇相機(jī)的重要參數(shù)——相機(jī)系統(tǒng)還必須將原始動(dòng)態(tài)范圍轉(zhuǎn)換為數(shù)字值，因此，必須了解相機(jī)的ADC能力。

大多數(shù)現(xiàn)代相機(jī)允許在數(shù)據(jù)收集期間選擇圖像的位深度，這是一個(gè)非常有用的特性。例如，12位圖像可以顯示從黑色到白色的全灰度作為4,096（212）個(gè)不同的灰度色調(diào)，而16位圖像可以存儲(chǔ)和顯示65,536（216）不同的灰度色調(diào)。

然而，16位圖像相對(duì)文件大小更大，而且讀取速度更慢，如果需要高速成像，應(yīng)選擇較低的位深度。相反，如果目標(biāo)是最大化對(duì)比度分辨率，特別是對(duì)于定量分析，應(yīng)使用更高的位深度。

除了位深度，還必須考慮相機(jī)傳感器能力。如果相機(jī)的動(dòng)態(tài)范圍僅為4000:1，那么在超過12位（4,096灰度值）的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字化純粹是浪費(fèi)時(shí)間和計(jì)算機(jī)內(nèi)存的。

熒光顯微鏡的相機(jī)要求：

熒光通常比明場(chǎng)的信號(hào)更弱，并且由于光毒性和光漂白，它并不適合長(zhǎng)曝光時(shí)間。因此，選擇一個(gè)具有高靈敏度和低噪聲的相機(jī)進(jìn)行熒光顯微鏡檢查是很重要的。

具有低讀取噪聲和低暗電流噪聲的相機(jī)是熒光顯微鏡的理想選擇。由于每次捕獲圖像時(shí)都會(huì)發(fā)生讀取噪聲，讀取噪聲越低，可以在不降低圖像質(zhì)量的情況下使用的增益就越高。這允許更短的曝光時(shí)間，這有助于限制暗電流噪聲。暗電流噪聲與溫度和時(shí)間有關(guān)，通常以給定溫度下的每秒電子數(shù)表示。在弱信號(hào)的情況下，即使是最好的相機(jī)，動(dòng)態(tài)范圍也會(huì)縮小。因此確定在典型數(shù)據(jù)采集條件下產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)范圍，將有助于確定在哪個(gè)位水平下執(zhí)行模數(shù)轉(zhuǎn)換。

幸運(yùn)的是，熒光圖像通常固有地具有較小的動(dòng)態(tài)范圍，較低的動(dòng)態(tài)范圍通常不會(huì)對(duì)圖像產(chǎn)生不利影響。

事實(shí)上，盡管了解了顯微相機(jī)的運(yùn)作模式和評(píng)估的關(guān)鍵參數(shù)，讓我們直接比較相機(jī)的數(shù)據(jù)并得出確切的結(jié)論并非易事，因此仍然推薦查看相機(jī)的參數(shù)后，在實(shí)際條件下去進(jìn)行相機(jī)試用測(cè)試，來確保能夠得出最佳的效果。

【文章來自MicroscopyEducation

Choosing the Best Camera System for Your Biological Light Microscopy Needs: Part II  W. Gray (Jay) Jerome

Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University, Nashville, TN  jay.jerome@vumc.org】

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