穩(wěn)定細胞株篩選具體方法過程
穩(wěn)定細胞株已廣泛應(yīng)用于重組蛋白、抗體生產(chǎn)、檢測分析、免疫治療藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域。表達的蛋白/抗體穩(wěn)定性更好，批次間差異小，是生物醫(yī)藥研發(fā)的基礎(chǔ)。有時候，為了滿足細胞需求，我們會構(gòu)建穩(wěn)定細胞株而不是瞬時轉(zhuǎn)染。相對瞬時轉(zhuǎn)染而言，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指進入細胞的質(zhì)粒整合入細胞基因組中，并能隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞下去。
穩(wěn)定細胞株篩選：
方法一：
先把質(zhì)粒整合到染色體上后，用相應(yīng)的質(zhì)粒DNA中的抗性標志來篩選該細胞系，單克隆篩選穩(wěn)定細胞株。
第一步：篩選濃度測定，以10~14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；
第二步：進行細胞接種，轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當天細胞密度應(yīng)達到60%~80% 覆蓋；
第三步：進行細胞轉(zhuǎn)染
第四步：利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進行篩選，并鑒定篩選結(jié)果。
方法二：
應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定細胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機整合進基因組。轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定細胞株的效率高，是建立穩(wěn)定株的方式。
第一步：將人源化的抗體基因轉(zhuǎn)接到慢病毒載體上，
第二步：使用包裝細胞，一般為293細胞，包裝出病毒，不同類型病毒包裝時間一般在3-5天。
第三步：用病毒轉(zhuǎn)染目的細胞。包裝好的病毒要先測滴度，根據(jù)滴度決定轉(zhuǎn)染目的細胞的病毒量。
第四步：后期篩選。轉(zhuǎn)染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩(wěn)定細胞株。
穩(wěn)定細胞株篩選：
方法一：
先把質(zhì)粒整合到染色體上后，用相應(yīng)的質(zhì)粒DNA中的抗性標志來篩選該細胞系，單克隆篩選穩(wěn)定細胞株。
第一步：篩選濃度測定，以10~14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；
第二步：進行細胞接種，轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當天細胞密度應(yīng)達到60%~80% 覆蓋；
第三步：進行細胞轉(zhuǎn)染
第四步：利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進行篩選，并鑒定篩選結(jié)果。
方法二：
應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定細胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機整合進基因組。轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定細胞株的效率高，是建立穩(wěn)定株的方式。
第一步：將人源化的抗體基因轉(zhuǎn)接到慢病毒載體上，
第二步：使用包裝細胞，一般為293細胞，包裝出病毒，不同類型病毒包裝時間一般在3-5天。
第三步：用病毒轉(zhuǎn)染目的細胞。包裝好的病毒要先測滴度，根據(jù)滴度決定轉(zhuǎn)染目的細胞的病毒量。
第四步：后期篩選。轉(zhuǎn)染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩(wěn)定細胞株。
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