利用密度梯度超速離心法從水稻幼苗中分離和富集高爾基體
Kazusato Oikawa¹, Shuichi Kani², Mark Hünken³
¹ Lab for Biomaterial Chemistry, Kyoto, Japan · ² Eppendorf Himac Technologies, Tokyo, Japan · ³ Eppendorf AG, Hamburg, Germany
摘要
獲得高質(zhì)量的高爾基體分離物，對于進一步分析和理解這種細胞器至關(guān)重要。Himac 目前隸屬于 Eppendorf集團，擁有 60 多年定制研發(fā)落地式超速離心機的豐富經(jīng)驗。在本應(yīng)用說明中，我們將采用一系列差速離心和非連續(xù)蔗糖密度梯度離心操作，使用 Himac CP80-NX離心機（搭配 P32ST 和 P40ST 水平轉(zhuǎn)子）從水稻幼苗中分離高爾基體。
引言
120 多年前，卡米洛 · 高爾基（Camillo Golgi）首次發(fā)現(xiàn)了真核細胞的高爾基體。之后，（電子）顯微技術(shù)的發(fā)展揭示了高爾基體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，而進一步的生化分析則闡明了細胞內(nèi)這種細胞器的各項功能 [2]。在高等生物細胞中，作為分泌途徑的一部分，高爾基體負責合成復(fù)合多糖體、加工蛋白質(zhì)并將蛋白質(zhì)分配到其他細胞器中（圖 2）[1]。
結(jié)果與討論
非連續(xù)密度梯度離心法是分離或富集亞細胞成分的標準方法。在大多數(shù)情況下，我們利用沉降系數(shù)或特定密度的差異來獲得分離物。在細胞器的分離應(yīng)用中，決定這些分離參數(shù)的主要因素是相應(yīng)膜的組成成分。獲得高純度的分離物通常比較困難，這一點在與其他膜系統(tǒng)緊密相連的高爾基體 [2] 上尤為明顯。
因此，高純度的高爾基體膜對于分析和研究高爾基體蛋白質(zhì)組 [1] 或細胞器內(nèi)特定的蛋白質(zhì)至關(guān)重要。
本文使用了兩種不同型號的水平轉(zhuǎn)子，配合一系列非連續(xù)蔗糖密度梯度離心步驟，高效可靠地獲得了高質(zhì)量的高爾基體分離物。
在棄掉第一道離心步驟中的細胞碎片后，將上清液裝入第一個非連續(xù)的蔗糖梯度上（見圖 3）。在 15% 和 50% 的蔗糖相之間為富集的微粒體部分。隨后，微粒體部分通過兩次非連續(xù)的蔗糖梯度浮選分離步驟而進一步被純化，其中高爾基體沉積在梯度為 34% 和 38% 的蔗糖相之間（圖 3）。Asakura 等人 [4] 的研究表明，經(jīng)過第二次浮選分離操作后，高爾基體部分的純度顯著提高�？梢圆捎妹庖哂≯E法對以下標記酶進行檢測，進而對高爾基體的質(zhì)量進行分析：例如 UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶：細胞質(zhì)基質(zhì)）、RbcL（二磷酸核酮糖羧化酶 長鏈：質(zhì)體）、COXII（細胞色素 C 氧化酶亞基 2：線粒體）和 ARF（腺苷核糖基化因子：高爾基體）。
結(jié)論
水平轉(zhuǎn)子 P32ST 和 P40ST 是分離高爾基體的理想選擇，兩者搭配可以實現(xiàn)從 40 mL 大容量離心管到 13 mL 小容量離心管的流暢切換，同時保證了優(yōu)秀的離心效果。Himac 13 mL PET離心管采用了特殊的細長造型，可實現(xiàn)更長的浮選距離，從而提升了高爾基體部分的純度。此外，轉(zhuǎn)子采用的頂部裝載設(shè)計，便于完成蔗糖梯度處理的精細操作，并且可以將意外混合污染的風(fēng)險降至最低。
Literature
¹ Lab for Biomaterial Chemistry, Kyoto, Japan · ² Eppendorf Himac Technologies, Tokyo, Japan · ³ Eppendorf AG, Hamburg, Germany
摘要
獲得高質(zhì)量的高爾基體分離物，對于進一步分析和理解這種細胞器至關(guān)重要。Himac 目前隸屬于 Eppendorf集團，擁有 60 多年定制研發(fā)落地式超速離心機的豐富經(jīng)驗。在本應(yīng)用說明中，我們將采用一系列差速離心和非連續(xù)蔗糖密度梯度離心操作，使用 Himac CP80-NX離心機（搭配 P32ST 和 P40ST 水平轉(zhuǎn)子）從水稻幼苗中分離高爾基體。
圖 1：搭載 P32ST 和 P40ST 型水平轉(zhuǎn)子的 CP 系列超速離心機
引言
120 多年前，卡米洛 · 高爾基（Camillo Golgi）首次發(fā)現(xiàn)了真核細胞的高爾基體。之后，（電子）顯微技術(shù)的發(fā)展揭示了高爾基體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，而進一步的生化分析則闡明了細胞內(nèi)這種細胞器的各項功能 [2]。在高等生物細胞中，作為分泌途徑的一部分，高爾基體負責合成復(fù)合多糖體、加工蛋白質(zhì)并將蛋白質(zhì)分配到其他細胞器中（圖 2）[1]。
葉綠體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運機制
(1) 通過TOC-TIC復(fù)合體的正常轉(zhuǎn)運途徑
(2) 通過分泌途徑的特殊轉(zhuǎn)運途徑（ER-高爾基體）
圖 2：植物細胞通過以下途徑完成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運：
（1）Toc-Tic復(fù)合體轉(zhuǎn)運機制（2）高爾基體和分泌途徑
(1) 通過TOC-TIC復(fù)合體的正常轉(zhuǎn)運途徑
(2) 通過分泌途徑的特殊轉(zhuǎn)運途徑（ER-高爾基體）
圖 2：植物細胞通過以下途徑完成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運：
（1）Toc-Tic復(fù)合體轉(zhuǎn)運機制（2）高爾基體和分泌途徑
α- 淀粉酶就屬于此類蛋白質(zhì)，它是一種負責植物內(nèi)淀粉分子水解的糖苷酶。研究表明，α- 淀粉酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）核糖體處合成并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中糖基化后被輸送到高爾基體進行低聚糖改性 [3]。然而，由于高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）等其他膜系統(tǒng)形成了復(fù)雜結(jié)構(gòu) [2]，因此分離這種細胞器的不同部分尤其困難。事實上，高爾基體膜的某些部位還經(jīng)常會被液泡等其他相連的膜系統(tǒng)污染 [2]。因此，在本應(yīng)用說明中，我們將使用一系列差速離心和密度梯度離心操作（富集特定膜系統(tǒng)的最成熟技術(shù)之一）[2]，從水稻幼苗中獲取高爾基體膜。用這種技術(shù)可以獲取高純度、高質(zhì)量提取物并用于質(zhì)譜等進一步的下游分析。下面我們將詳細介紹使用 CP80-NX 超速落地式離心機（搭配 P32ST 和P40ST 轉(zhuǎn)子）分離獲取高質(zhì)量高爾基體的過程。
材料與方法
所用材料
CP80NX 超速離心機搭配以下水平轉(zhuǎn)子：
1. P32ST 型水平轉(zhuǎn)子，適用于 40 mL PET 離心管
2. P40ST 型水平轉(zhuǎn)子，適用于 13 mL PET 離心管
材料與方法
所用材料
CP80NX 超速離心機搭配以下水平轉(zhuǎn)子：
1. P32ST 型水平轉(zhuǎn)子，適用于 40 mL PET 離心管
2. P40ST 型水平轉(zhuǎn)子，適用于 13 mL PET 離心管
第 1 步：
使用 P32ST 型水平轉(zhuǎn)子 （40 mL PET 離心管） 和 P40ST 型水平轉(zhuǎn)子 （13 mL PET 離心管），完成微粒體純化過程。
1. 在 4°C 條件下，使用水平轉(zhuǎn)子，在 40 mL PET 離心管中以15,000 x g 的速度離心純化水稻提取物 30 分鐘，并移除沉降物。
2. 在 13 mL PET 離心管中，底部鋪墊 1 mL 50% 濃度蔗糖溶液，中間層裝入 1 mL 15% 蔗糖溶液，頂部裝入 11 mL 上清液。15% 蔗糖溶液置于 1 mL 50% 蔗糖墊層之上，將11 mL 上清液裝入 1 mL 15% 蔗糖溶液頂部。
3. 在 4°C 條件下，以 100,000 × g 的離心力離心 3 小時，然后收集 50% 蔗糖墊層溶液中截留的微粒體部分。
使用 P32ST 型水平轉(zhuǎn)子 （40 mL PET 離心管） 和 P40ST 型水平轉(zhuǎn)子 （13 mL PET 離心管），完成微粒體純化過程。
1. 在 4°C 條件下，使用水平轉(zhuǎn)子，在 40 mL PET 離心管中以15,000 x g 的速度離心純化水稻提取物 30 分鐘，并移除沉降物。
2. 在 13 mL PET 離心管中，底部鋪墊 1 mL 50% 濃度蔗糖溶液，中間層裝入 1 mL 15% 蔗糖溶液，頂部裝入 11 mL 上清液。15% 蔗糖溶液置于 1 mL 50% 蔗糖墊層之上，將11 mL 上清液裝入 1 mL 15% 蔗糖溶液頂部。
3. 在 4°C 條件下，以 100,000 × g 的離心力離心 3 小時，然后收集 50% 蔗糖墊層溶液中截留的微粒體部分。
第 2 步：
使用 P40ST型水平轉(zhuǎn)子 （13 mL PET離心管），從微粒體部分純化高爾基體。
1. 使用手持糖量儀，利用 60% 蔗糖緩沖液將收集的微粒體蔗糖溶液密度中和至 42%。在該溶液上層裝入 1-2 mL 其他非連續(xù)蔗糖密度梯度，每個梯度由 1 mL 濃度為 26%、30%、34% 和 38% 的蔗糖層組成。隨后，小心地加滿水至13 mL。
2. 4°C，100,000 × g 離心 3 小時，然后迅速收集漂浮在34% 和 38% 蔗糖層之間界面相的高爾基體部分（1）。
3. 再次將收集的高爾基體部分中和至蔗糖密度 42%，然后再次裝入 1-2 mL 不連續(xù)的蔗糖梯度溶液，每個梯度由 1 mL 26%、30%、34% 和 38% 的蔗糖層組成。小心加滿水至13 mL。
4 .4°C， 100,000 × g 離心 3 小時，然后收集漂浮在 34% 和38% 蔗糖層之間界面相的高爾基體部分（2）。
通過使用細長的 13 mL 離心管完成兩次浮選離心，即可從微粒體中分離出高純度的高爾基體。回收后的高爾基體部分（2）可用于實驗和印跡分析。所有蔗糖濃度單位均為質(zhì)量百分比（w/w）。
使用 P40ST型水平轉(zhuǎn)子 （13 mL PET離心管），從微粒體部分純化高爾基體。
1. 使用手持糖量儀，利用 60% 蔗糖緩沖液將收集的微粒體蔗糖溶液密度中和至 42%。在該溶液上層裝入 1-2 mL 其他非連續(xù)蔗糖密度梯度，每個梯度由 1 mL 濃度為 26%、30%、34% 和 38% 的蔗糖層組成。隨后，小心地加滿水至13 mL。
2. 4°C，100,000 × g 離心 3 小時，然后迅速收集漂浮在34% 和 38% 蔗糖層之間界面相的高爾基體部分（1）。
3. 再次將收集的高爾基體部分中和至蔗糖密度 42%，然后再次裝入 1-2 mL 不連續(xù)的蔗糖梯度溶液，每個梯度由 1 mL 26%、30%、34% 和 38% 的蔗糖層組成。小心加滿水至13 mL。
4 .4°C， 100,000 × g 離心 3 小時，然后收集漂浮在 34% 和38% 蔗糖層之間界面相的高爾基體部分（2）。
通過使用細長的 13 mL 離心管完成兩次浮選離心，即可從微粒體中分離出高純度的高爾基體。回收后的高爾基體部分（2）可用于實驗和印跡分析。所有蔗糖濃度單位均為質(zhì)量百分比（w/w）。
非連續(xù)密度梯度離心法是分離或富集亞細胞成分的標準方法。在大多數(shù)情況下，我們利用沉降系數(shù)或特定密度的差異來獲得分離物。在細胞器的分離應(yīng)用中，決定這些分離參數(shù)的主要因素是相應(yīng)膜的組成成分。獲得高純度的分離物通常比較困難，這一點在與其他膜系統(tǒng)緊密相連的高爾基體 [2] 上尤為明顯。
因此，高純度的高爾基體膜對于分析和研究高爾基體蛋白質(zhì)組 [1] 或細胞器內(nèi)特定的蛋白質(zhì)至關(guān)重要。
本文使用了兩種不同型號的水平轉(zhuǎn)子，配合一系列非連續(xù)蔗糖密度梯度離心步驟，高效可靠地獲得了高質(zhì)量的高爾基體分離物。
在棄掉第一道離心步驟中的細胞碎片后，將上清液裝入第一個非連續(xù)的蔗糖梯度上（見圖 3）。在 15% 和 50% 的蔗糖相之間為富集的微粒體部分。隨后，微粒體部分通過兩次非連續(xù)的蔗糖梯度浮選分離步驟而進一步被純化，其中高爾基體沉積在梯度為 34% 和 38% 的蔗糖相之間（圖 3）。Asakura 等人 [4] 的研究表明，經(jīng)過第二次浮選分離操作后，高爾基體部分的純度顯著提高�？梢圆捎妹庖哂≯E法對以下標記酶進行檢測，進而對高爾基體的質(zhì)量進行分析：例如 UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶：細胞質(zhì)基質(zhì)）、RbcL（二磷酸核酮糖羧化酶 長鏈：質(zhì)體）、COXII（細胞色素 C 氧化酶亞基 2：線粒體）和 ARF（腺苷核糖基化因子：高爾基體）。
結(jié)論
水平轉(zhuǎn)子 P32ST 和 P40ST 是分離高爾基體的理想選擇，兩者搭配可以實現(xiàn)從 40 mL 大容量離心管到 13 mL 小容量離心管的流暢切換，同時保證了優(yōu)秀的離心效果。Himac 13 mL PET離心管采用了特殊的細長造型，可實現(xiàn)更長的浮選距離，從而提升了高爾基體部分的純度。此外，轉(zhuǎn)子采用的頂部裝載設(shè)計，便于完成蔗糖梯度處理的精細操作，并且可以將意外混合污染的風(fēng)險降至最低。
Literature
[1] Oikawa K. et al. (2018): Proteomic Analysis of Rice Golgi Membranes Isolated by Floating Trough Discontinuous Sucrose Density Gradient, Methods in Molecular Biology, Chapter 6, 91-105.
[2] Parsons H.T. et al. (2012): The Current State of the Golgi Proteomes, Proteomic Applications in Biology, Dr. Joshua Heazlewood (Ed.).
[3] Kitajima A. et al. (2009): The Rice α-Amylase Glycoprotein Is Targeted from the Golgi Apparatus through the Secretory Pathway to the Plastids; The Plant Cell, Vol. 21: 2844-2858.
[4] Asakura T. et al. (2006): Isolation and proteomic analysis of rice Golgi membranes: Cis-Golgi membranes labeled with GFP-SYP31. Plant Biotechnology 23, 475–485.
[2] Parsons H.T. et al. (2012): The Current State of the Golgi Proteomes, Proteomic Applications in Biology, Dr. Joshua Heazlewood (Ed.).
[3] Kitajima A. et al. (2009): The Rice α-Amylase Glycoprotein Is Targeted from the Golgi Apparatus through the Secretory Pathway to the Plastids; The Plant Cell, Vol. 21: 2844-2858.
[4] Asakura T. et al. (2006): Isolation and proteomic analysis of rice Golgi membranes: Cis-Golgi membranes labeled with GFP-SYP31. Plant Biotechnology 23, 475–485.
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