應(yīng)用 | 通過 Gilson GX-274 ASPEC®全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)從小麥中提取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON)
 

 小麥  是世界上主要的谷類作物之一，其制成的面粉廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。小麥及其制品受多種微生物的影響，特別是能產(chǎn)生真菌毒素的產(chǎn)毒真菌。測(cè)定小麥及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol-DON)的含量對(duì)公眾健康至關(guān)重要。
 

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON） （3α，7α，15-三羥基-12，13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮）（圖 1）是一種屬于單端孢霉烯族的真菌毒素，由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生，也稱為嘔吐毒素。其主要存在于小麥和大米等谷物中。DON在高溫下穩(wěn)定，因此可在加工過程中存留，從而污染小麥及其制品。事實(shí)上，亞洲已經(jīng)報(bào)告了幾起與 DON 污染相關(guān)的急性病暴發(fā)。人類攝入受 DON 污染的食物會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、眩暈、胃腸道紊亂和腹瀉等癥狀。此外，體外研究表明， DON還可能具有潛在遺傳毒性¹。
 

 圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，CAS nº 51481-10-8
 

2017年2月8日，巴西制定了RDC No.138法規(guī)，規(guī)定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在包括小麥、全麥面粉、意大利面、餅干等一些產(chǎn)品中的最大限量。全麥和全麥面粉中，DON的最大限量為1250μg/kg。²

食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定包括以下步驟：提取、凈化、洗脫和色譜定量。在本應(yīng)用中 ，待測(cè)物的凈化和洗脫步驟通過 GX-274 ASPEC®全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)自動(dòng)化完成。通過分析方法驗(yàn)證， 確保結(jié)果的可靠性。對(duì)照樣品的使用對(duì)于儀器的準(zhǔn)確度評(píng)估至關(guān)重要。³ 在本應(yīng)用中使用小麥對(duì)照樣品 B-MYC0856 對(duì) GX-274 ASPEC®系統(tǒng)的準(zhǔn)確度、精確度（可重復(fù)性和中間精密度）、檢測(cè)限及定量限的驗(yàn)證。

材料和方法
 

樣品

對(duì)照樣品B‑MYC0856天然污染的小麥粉，DON標(biāo)準(zhǔn)值含量為877μg/kg±23 μg/kg，購(gòu)自LGCStandards（Wesel, Germany）。
 

主要儀器與試劑

• Gilson GX-274 ASPEC®全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng) (Gilson, Inc.; Middleton, WI, USA)
色譜純甲醇和乙腈購(gòu)自Merck，Darmstadt，Germany。DON（D0156）購(gòu)自Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 。

• DonStar™ R 免 疫 親 和 柱 (PN COIAC5004).
(Romer Labs；Union,MO,USA)
• C18 反相分析柱(PN R0086200C5), MicrosorbMV 100-5, 250 x 4.6 mm, 5 μm.(Varian Medical Systems; Walnut Creek, CA)
• C18反相保護(hù)柱，ZORBAX, 4x3 mm.(Agilent Technologies；Palo Alto,CA,USA)
 

色譜分析條件：

Alliance 2695 HPLC 系統(tǒng)

• 流動(dòng)相：水:甲醇:乙腈 (80:15:5; v/v/v)
• 流速：0.7 mL/min
• 柱溫：30°C
• 進(jìn)樣量：50 μL
• 檢測(cè)：220nm 紫外波長(zhǎng)
 

方法

在12.5g樣品中加入100 mL去離子水(電阻率18 MΩ.cm)， 置于水平搖床上以 200 rpm 的速度振蕩30分鐘。然后將樣品轉(zhuǎn)移到聚丙烯(PP)離心管中，3000 rpm離心10分鐘。上清液通過超細(xì)纖維濾紙過濾，濾液收集于10mL試管中，轉(zhuǎn)移至 GX-274 ASPEC®全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)進(jìn)行凈化。DonStar™ R免疫親和萃取柱已事先用 Gilson 3mL柱蓋密封。在Gilson TRILUTION® LH 軟件控制下，GX-274 ASPEC®全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)上的樣品前處理分為兩個(gè)步驟：凈化和洗脫（圖2）。
 

圖2 TRILUTION®LH 軟件中樣品前處理步驟：樣品的凈化和 DON 的洗脫

自動(dòng)化樣品制備總結(jié)
 

步驟 1：樣品凈化

• 將2 mL濾液添加至免疫親和柱上，流速 0.5mL/min。

• 用10 mL超純水清洗免疫親和柱，流速 2mL/min，清洗兩次。

• 因?qū)嶒?yàn)室中的氮?dú)庠磯毫Φ停?從Gilson GX-274 ASPEC^®全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)中取出免疫親和柱。放入濃縮儀中以1400 轉(zhuǎn)/分的速度離心干燥5分鐘。
 

步驟 2：洗脫

• 將免疫親和柱重新放回于Gilson GX-274 ASPEC^®全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)。用 2mL甲醇洗脫DON，流速0.5 mL/min。洗脫液收集于5mL試管中。

從Gilson GX-274 ASPEC^®全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)中取出試管并置于45°C水浴中。在氮?dú)饬飨拢�蒸發(fā)至干燥。將蒸干的提取物溶解在1.0 mL水中，渦旋，隨后用0.45 μm PTFE膜過濾。收集濾液用于進(jìn)一步的液相色譜分析。通過外標(biāo)法對(duì) DON進(jìn)行定量。

結(jié)果與討論

在本應(yīng)用中，我們報(bào)道了從小麥樣品中自動(dòng)化分離DON的樣品制備方法。使用 GX-274 ASPEC^®全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)自動(dòng)化樣品前處理和洗脫步驟，使用 HPLC 法檢測(cè)DON。HPLC檢測(cè)結(jié)果表明，使用免疫親和柱進(jìn)行凈化可以有效去除基質(zhì)背景（圖 3）。根據(jù)巴西國(guó)家計(jì)量、標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)質(zhì)量研究所的建議，我們對(duì)準(zhǔn)確度、精確度、檢測(cè)限和定量限等參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。³ 
 

圖3 高效液相色譜-紫外檢測(cè)小麥樣品中 DON 的含量(λ = 220 nm, DON 的保留時(shí)間：10.1 min)。

檢測(cè)限和定量限約分別為信噪比（S/N）的3和10倍（表1）。定量限與校準(zhǔn)曲線的第一點(diǎn)匹配（圖 4）。
 

表1 LC/MS 分析條件
 

圖4 校準(zhǔn)曲線(濃度范圍 50-1000 ng/mL，對(duì)應(yīng)最終樣品濃度 200-4000 μg/kg)
 

通過回收率試驗(yàn)評(píng)估了該方法的準(zhǔn)確度。在單一濃度水平下對(duì)對(duì)照樣品進(jìn)行六次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算 DON 的平均濃度、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。測(cè)得 DON 的回收率在 99.5%至 104.9%之間，可計(jì)算出平均回收率為102.0%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度（表 2）。
 

表2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON） 的回收率
 

精確度是指在確定條件下，對(duì)同一樣品進(jìn)行獨(dú)立和重復(fù)測(cè)量所得結(jié)果的離散度。它通常用標(biāo)準(zhǔn)偏差或變異系數(shù)數(shù)值表示。精確度的測(cè)量要求在相同的測(cè)量程序、相同的測(cè)量人員和相同參數(shù)下的相同儀器進(jìn)行。對(duì)照樣品在同一天進(jìn)行了六次檢測(cè)。DON測(cè)定的濃度平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)見表3。這些數(shù)據(jù)表明該方法具有良好的重復(fù)性。中間精密度由兩名檢測(cè)人員在不同的兩天內(nèi)對(duì)同一樣品進(jìn)行六次檢測(cè)來評(píng)估。同日和不同日的變異系數(shù)均在 3%以下(表3)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，同一實(shí)驗(yàn)室不同檢測(cè)人員不同日的結(jié)果差異不顯著。
 

表 3 對(duì)照樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON） 濃度的測(cè)定以檢測(cè)精確度

總結(jié)及應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

將小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）提取的步驟自動(dòng)化能夠精確控制上樣體積和流速。變異系數(shù)低于3%，確保了不同批次樣品結(jié)果的一致性。平均回收率為102%，證明了該方法的準(zhǔn)確性。

該方法符合巴西現(xiàn)行立法�？梢暂p易地將一個(gè)手動(dòng)操作步驟融入到自動(dòng)化過程中，以滿足實(shí)驗(yàn)室要求。在同一應(yīng)用中，TRILUTION®LH 軟件可以兼顧順序和批量需求，以提高可重復(fù)性。GX-274 ASPEC®全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)能夠同時(shí)處理 4 個(gè)樣品，提高效率和通量。

訂貨信息

*其他附屬配件請(qǐng)咨詢 Gilson 授權(quán)銷售人員。

 

參考文獻(xiàn)：

1. Almeida, A.P., Lamardo, L.C., Shundo, L., Silva, S.A.,Navas, S.A., Alaburda, J., Ruvieri, V., Sabino, M.Occurrence of deoxynivalenol in wheat flour, instant noodle and biscuits commercialized in Brazil. Food Addit. Contam. Part B Surveill., 9, 251-255 (2016).

2.Resolução RDC No. 138 de 8 de fevereiro de 2017. Altera a Resolução da Diretoria Colegiada – RDC No.7, de 18 de fevereiro de 2011, que dispõe sobre limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos, para alterar os LMT da micotoxina deoxinivalenol (DON) em trigo e produtos de trigo prontos para oferta ao consumidor e os prazos para suaaplicação.

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2017/rdc0138_08_02_2017.pdf

3.Orientação sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, 2011).

4.Vocabulário Internacional de Metrologia, Conceitos fundamentais e gerais de termos associados (Instituto Português da Qualidade, 2012).