基因編輯技術(shù)CRISPR的應(yīng)用新進展與挑戰(zhàn)
從2013年首次宣布CRISPR-CAS9系統(tǒng)可以應(yīng)用于哺乳動物開始，CRISPR技術(shù)因其高效率、易操作和低成本，正在基因編輯領(lǐng)域掀起一場新的革命。2015年，張峰首次在NatureMedicine上撰文并總結(jié)了CRISPR臨床轉(zhuǎn)化所面臨的的三個挑戰(zhàn)，即基因編輯效率、特異性和遞送手段。經(jīng)過五年發(fā)展，2020年JenniferA.Doudna在Nature中的文章針對這三個挑戰(zhàn)提出相應(yīng)的解決方案，盡管CRISPR系統(tǒng)目前在臨床轉(zhuǎn)化中仍面臨多樣的技術(shù)瓶頸技術(shù)，但其在臨床一期實驗中對遺傳性淀粉樣蛋白疾�。╤ATTR）的成功治療表明CRISPR系統(tǒng)依然具有光明的應(yīng)用前景。本文將從基因編輯效率、特異性和遞送手段三個方面闡述近幾年CRISPR系統(tǒng)的進展。
基因編輯的有效性
CRISPR/Cas9發(fā)現(xiàn)之初只能用于雙鏈DNA編輯。2017年,張峰實驗室發(fā)現(xiàn)Cas13a和Cas13b可在引導RNA(sgRNA)的作用下對RNA進行切割,此后更多的Cas13家族成員如Cas13d、Cas13X和Cas13Y被發(fā)現(xiàn)，拓展了RNA編輯中編輯工具的選擇范圍。除了靶向雙鏈DNA和RNA外，JenniferA.Doudna還發(fā)現(xiàn)了一種新的Cas14蛋白，它可以不需要PAM序列而對單鏈DNA進行非特異性切割，基于此特性該蛋白已成功應(yīng)用于病毒核酸檢測。
基于CRISPR/Cas切割活性的第一代CRISPR編輯系統(tǒng)主要依賴于細胞中非同源末端連接(NHEJ)機制介導基因敲除或依賴于同源重組修復（HDR）機制介導基因敲入。盡管CRISPR系統(tǒng)可通過HDR介導基因敲入，但由于HDR僅在G2和S期細胞中活性較高，因此，對于細胞分裂緩慢或處于有絲分裂后期的細胞，如神經(jīng)元，基于HDR策略的基因敲入并不適用；另外，HDR介導的基因組編輯方法是依賴Cas9在目標位點引入雙鏈DNA斷裂和糾正模板來恢復基因功能，然而雙鏈DNA斷裂一旦形成，DNA損傷很容易通過NHEJ途徑而不是HDR進行修復。因此，上述兩種因素導致HDR介導的基因修復效率較低，在體內(nèi)僅達到0.1%-6.5%的編輯效率。由于第一代CRISPR編輯系統(tǒng)在基因改造如基因點突變、基因片段插入的效率較低，因此其主要應(yīng)用與基因敲除實驗，并以完成一個臨床一期試驗及多個研究者發(fā)起的臨床研究（InvestigatorInitialed Trial，IIT）。
盡管目前CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠通過引入框外突變而有效地敲除靶基因，但在進行基因缺失研究時必須注意基因補償反應(yīng)(genetic compensation response, GCR)。事實上，通過CRISPR敲除一個基因有時并沒有表現(xiàn)出應(yīng)有的表型差異，而利用RNA干擾手段敲低同一基因卻有可能產(chǎn)生明顯表型。這種差異是由于利用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除某一基因，但同時導致同一家族中其他成員基因表達上調(diào)所致。2019年，兩個研究小組證實，CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除某一基因產(chǎn)生的短核苷酸序列突變可導致該基因其他同家族成員啟動子區(qū)域表觀遺傳學修飾改變，并促進該基因其他家族成員的轉(zhuǎn)錄，進而補償原有基因敲除所誘發(fā)的表型改變。該機制的發(fā)現(xiàn)有助于解釋以往基于CRISPR/Cas系統(tǒng)建立的基因敲除模型中一些意想不到的表型結(jié)果。
2016年和2017年,劉如謙實驗室分別將胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶與Cas9結(jié)合從而開創(chuàng)性地建立了第二代基因編輯系統(tǒng)-堿基編輯器(BE)。該系統(tǒng)包含胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和鳥嘌呤編輯器（GBE）可以在不需要模板DNA和雙鏈DNA斷裂的情況下分別實現(xiàn)C·T、A·G和C·G核苷酸之間的轉(zhuǎn)化。除了在DNA中進行基因編輯，張峰實驗室還開發(fā)了一個基于Cas13的REPAIR系統(tǒng)，在RNA水平上實現(xiàn)腺苷A→肌苷I（鳥苷G）置換；魏文勝課題組則通過建立LEAPER系統(tǒng)，利用特殊設(shè)計的RNA（ADAR-recruitingRNA,arRNA）招募細胞中內(nèi)源脫氨酶ADAR，實現(xiàn)靶向目標RNA中腺苷A→肌苷I（鳥苷G）轉(zhuǎn)換；由于上述兩種RNA堿基編輯不依賴內(nèi)源性修復途徑。因此，即使在有絲分裂后期的細胞，如神經(jīng)元，REPAIR和LEAPER系統(tǒng)也同樣能夠介導有效的RNA編輯。與DNA編輯相反，RNA編輯是短暫的，更容易逆轉(zhuǎn)，允許對編輯結(jié)果進行暫時控制。由于堿基編輯器的DNA和RNA靶向是由單一sgRNA主導的，因此，通過轉(zhuǎn)染多個sgRNA就有可能并行地進行多個基因突變。然而，與之對比，利用HDR同時引入多個基因突變是非常困難的，即使在分裂細胞中效率也極低，實用性較差。最新的C·T、A·G和C·G堿基編輯器的基因點突變置換效率可分別達到~50%、~57%和~15%�；谀壳暗膲A基編輯技術(shù)原則上可以治療超過70%的人單基因遺傳病。
胞苷堿基編輯器可將C轉(zhuǎn)換為T，腺嘌呤堿基編輯器可將A轉(zhuǎn)換為G，鳥嘌呤編輯器可將C轉(zhuǎn)換G。但是還有9種其它類型的核苷酸變化：如T轉(zhuǎn)換為A和A轉(zhuǎn)換為T，是這三種堿基編輯器無法完成的操作；另外，堿基編輯器也無法實現(xiàn)堿基片段的插入和刪除。2019年劉如謙課題組開發(fā)了先導編輯器，通過將nickaseCas9蛋白與逆轉(zhuǎn)錄酶形成復合物，在向?qū)NA的引導下，該復合物可以在特定DNA區(qū)域添加、改變、或者移除目標核苷酸，也可實現(xiàn)所有12種單核苷酸轉(zhuǎn)換，插入最長為44個核苷酸的新DNA序列，或刪除長達80個堿基對的序列。之后該課題組在2021年進一步發(fā)現(xiàn)DNA錯配修復(MMR）途徑可強烈抑制先導編輯效率，并通過瞬時表達顯性負相關(guān)MMR蛋白(MLH1dn)，使其達到了30%~50%的編輯效率。先導基因編輯技術(shù)原則上可以治療超過89%的人類遺傳病。
除細胞核內(nèi)基因組突變外，線粒體基因組由母系遺傳，其突變可導致包括萊伯遺傳性視神經(jīng)病變和線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作等多種人類遺傳病，因此開發(fā)針對線粒體的基因編輯具有重要意義。然而，由于向?qū)NA無法穿過線粒體膜，因此CRISPR-Cas平臺不適用于編輯線粒體中的這類突變。2020年和2022年劉如謙和Jin-SooKim課題組通過分別將胞苷脫氨基酶DddA和腺嘌呤脫氫酶TadA8e和特異的DNA序列結(jié)合蛋白TALE構(gòu)建形成融合蛋白，開發(fā)了線粒體胞嘧啶堿基編輯器（DdCBE）和線粒體腺苷酸堿基編輯器（TALED）。由于DdCBE和TALED可分別實現(xiàn)C到T，和A到G的轉(zhuǎn)化，原則上可以校正>53%的已知線粒體突變位點。
基因編輯的特異性
雖然CRISPR/Cas9技術(shù)在基因編輯方面比ZFN和TALEN表現(xiàn)出更高的保真度，但在生物學或臨床應(yīng)用中其脫靶效應(yīng)仍是一個主要問題。CRISPR/Cas9編輯技術(shù)保真性的提高可通過優(yōu)化重組Cas9蛋白和改造sgRNA序列實現(xiàn)。例如，新的Cas9變異體如EvoCas9、HypaCas9、Cas9-HF、eSpCas9和SniperCas9，表現(xiàn)為較低的脫靶性，盡管與野生型Cas9相比，它們的在靶活性會降低。傳統(tǒng)的sgRNA序列包含與目標DNA序列互補的20個核苷酸，然而研究人員發(fā)現(xiàn)，使用截短的sgRNA，如17或18核苷酸長度，可以將一些脫靶位點的發(fā)生率降低5000倍之多，而不犧牲目標基因組編輯效率。除了縮短sgRNA的長度，D.DewranKocak發(fā)現(xiàn)在sgRNA的5'端添加一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以提高Cas9和其他Cas效應(yīng)蛋白的特異性，平均提高55倍。除了提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的精度，其他Cas效應(yīng)蛋白也可被用于真核細胞的基因編輯，并展現(xiàn)出比Cas9更高的特異性。例如，Cas12a和Cas12b作為與Cas9在細胞切割活性相似的新型編輯蛋白，其對sgRNA和目標DNA之間的單核苷酸錯配具有很高的敏感性，因此，與CRISPR-Cas9工具相比，它們減少了脫靶效應(yīng)。
堿基編輯器自2016年首次報道以來受到了廣泛的關(guān)注。然而，在2019年，堿基編輯工具的安全性受到了廣泛質(zhì)疑，先是楊輝等研究組報道了胞嘧啶單堿基編輯器存在嚴重的DNA脫靶，接著KeithJoung團隊、劉如謙團隊和楊輝團隊又分別報道了胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器存在大量的RNA脫靶效應(yīng)，其RNA脫靶效應(yīng)主要由堿基編輯器中和Cas9蛋白偶聯(lián)的胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶與RNA的偏好性結(jié)合導致。其中DNA水平的脫靶效應(yīng)可分為Cas依賴型和Cas非依賴型脫靶。Cas依賴型脫靶在ABEs和CBEs均有發(fā)生，可通過使用高特異性的Cas蛋白及突變體、截短型sgRNA而優(yōu)化。Cas非依賴型脫靶源自脫氨基酶與細胞內(nèi)基因組中瞬時存在的單鏈DNA的相互作用，主要發(fā)生在CBEs系統(tǒng)中。目前研究者主要通過構(gòu)建脫氨基酶突變體和不同類型的脫氨基酶篩選對此加以優(yōu)化。由于CBEs和ABEs系統(tǒng)中的脫氨基酶多可作用于RNA的堿基發(fā)揮脫氨基作用，早期開發(fā)的單堿基編輯器多在RNA水平存在明顯的脫靶效應(yīng)。目前研究者多通過蛋白質(zhì)工程構(gòu)建脫氨基酶的突變體以降低其在RNA水平的脫靶風險。
先導編輯目前研究發(fā)現(xiàn)其基因編輯精準度較高，只會產(chǎn)生少量的pegRNA依賴性的脫靶突變，進一步通過全基因組和全轉(zhuǎn)錄組水平研究發(fā)現(xiàn)先導編輯器不會導致pegRNA非依賴性脫靶突變，證明了先導編輯的安全性。
盡管TALED編輯技術(shù)沒有發(fā)現(xiàn)細胞毒性，也不會引起mtDNA的不穩(wěn)定和細胞核DNA中的脫靶效應(yīng)；但DdCBE編輯技術(shù)中，DdCBE可進入細胞核，導致其在核基因組上產(chǎn)生了嚴重的脫靶效應(yīng)。
CRISPR系統(tǒng)的遞送方法
CRISPR系統(tǒng)體內(nèi)遞送是實現(xiàn)其臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，目前有三種主要的傳遞策略，包括基于質(zhì)粒的遞送、CasmRNA和sgRNA的遞送以及Cas蛋白和sgRNA的直接傳遞(表1)。
表1CRISPR系統(tǒng)不同遞送方法匯總
基于質(zhì)粒的CRISPR遞送系統(tǒng),目前最廣泛的使用工具是腺相關(guān)病毒（AAV），AAV具有低免疫原性、感染效率高和無人致病性等特點,其最大包裝長度為4.7kb的基因片段。編碼SpCas9蛋白的mRNA大小約為4.3 kb，加上啟動子和多聚腺苷化信號等其他必需序列，所需元件長度已達4.7 kb，因此無法實現(xiàn)將Cas9和sgRNA構(gòu)建到同一AAV載體中。一種解決方案是使用雙AAV系統(tǒng)，將編碼Cas9蛋白的mRNA和sgRNA分別裝入兩個AAV載體中。另一種方法使用較小尺寸的Cas蛋白。對于DNA編輯，CasX和CasMINI來源于非致病微生物，其編碼序列長度分別約為2.9kb和1.5kb，具有特異的DNA切割特性，可成為潛在的Cas9替代蛋白。在RNA編輯方面，Cas13d編碼序列大小為2.8kb，比Cas13a、Cas13b等其他Cas13家族成員小，同樣也易于AAV包裝。
近年來，細胞外泌體已成為新的CRISPR系統(tǒng)遞送方法。紅細胞無基因組DNA，且外泌體分泌數(shù)量較高，另外，來自健康獻血者的O型血缺乏表面抗原，因此O型血來源的外泌體具有較低的免疫源性；Cas9mRNA和sgRNA可通過電穿孔方法導入純化的外泌體中。Cas9核酸酶與sgRNA形成的核糖核蛋白(RNP)復合體可以穿過細胞核進行基因編輯，因此與轉(zhuǎn)染CRISPR質(zhì)�；騧RNA相比，Cas蛋白直接遞送具有作用速度快、免疫源低等獨特優(yōu)點。另外近年來病毒樣顆粒作為潛在的基因藥物遞送載體也備受關(guān)注，張峰、劉如謙和蔡宇伽課題組相繼開發(fā)了用于CRISPR系統(tǒng)遞送的SEND、VLP和mLP平臺；由于病毒樣顆粒缺乏病毒的遺傳物質(zhì)，它們可能比其他使用病毒的遞送方法更安全。
盡管CRISPR系統(tǒng)能夠通過不同的策略被遞送到細胞中，但其持續(xù)表達可能帶來由于脫靶導致的毒副作用。例如，Cas9可在非靶點位置引起大片段刪除和染色質(zhì)破碎；Cas9切割雙鏈DNA可引發(fā)p53介導的DNA損傷反應(yīng)，抑制細胞生長。因此，在基因編輯完成后，應(yīng)抑制CRISPR系統(tǒng)活性，以避免脫靶和毒性作用。幸運的是，一些抗Cas蛋白如AcrIIA4、AcrIIC1和AcrIIC3以及硫代修飾的DNA寡核苷酸已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，它們能夠通過不同的機制抑制Cas9或Cas12a的在靶活性，因此，在臨床應(yīng)用中這兩種抑制劑都可作為潛在的CRISPR系統(tǒng)解毒劑。
結(jié)論
CRISPR技術(shù)的快速發(fā)展大大提高了我們對真核細胞基因組進行精確編輯的能力。雖然基因編輯技術(shù)目前仍然面臨脫靶性和遞送效率偏低等多種問題，但相信上述問題將在未來的跨學科整合和科學家的合作中逐步得到解決�；蚓庉嫾夹g(shù)的臨床轉(zhuǎn)化研究將推動個性化醫(yī)療的快速發(fā)展。
來源：細胞與基因治療領(lǐng)域
