阿爾茨海默病(AD)是一種廣泛的神經(jīng)退行性腦疾病，它影響著全球約4400萬人。雖然目前對(duì)AD的特征有了一定的了解，但多種分子和細(xì)胞變化機(jī)制仍不清楚。

最近，在細(xì)胞間發(fā)揮通信作用的細(xì)胞外囊泡(EV)正成為一種新的疾病治療熱點(diǎn)。已有研究表明，從腦組織和生物液體中分離出來的EV在AD中發(fā)生了改變，因此，從患者的生物體液或活檢樣本中捕獲細(xì)胞類型特異性EV，并對(duì)其進(jìn)行分析，成為研究AD的一種新方法。

2022年，來自哈佛醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在Journal of Extracellular Vesicles（IF 21.224）發(fā)表了一篇題為“Human neural cell type-specific extracellular vesicle proteome defines disease-related molecules associated with activated astrocytes in Alzheimer's disease brain”的研究論文。文章利用labelfree蛋白組學(xué)和TMT蛋白組學(xué)研究了不同細(xì)胞類型中的EV的蛋白質(zhì)組譜并鑒定出新的細(xì)胞類型特異性EV蛋白標(biāo)記物，同時(shí)證明了細(xì)胞類型特異性EV在AD進(jìn)展中發(fā)揮的重要作用，并可作為AD的潛在生物標(biāo)志物。

研究材料
人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)分化的神經(jīng)細(xì)胞，健康對(duì)照、輕度認(rèn)知障礙患者和阿爾茲海默癥患者的腦組織

技術(shù)路線
· 步驟1：人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)分化為四種類型的神經(jīng)細(xì)胞；
· 步驟2：分化的四種神經(jīng)細(xì)胞中提取胞外囊泡（EV）；
· 步驟3：四種神經(jīng)細(xì)胞EV蛋白質(zhì)組的比較分析；
· 步驟4：細(xì)胞類型特異性EV中標(biāo)志蛋白的確定；
· 步驟5：人類腦組織中分離的EV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析；
· 步驟6：細(xì)胞類型特異性EV蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建；
· 步驟7：M7模塊與激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的EV和AD病理的相關(guān)性分析。

研究結(jié)果
1. 人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化及分化有效性確認(rèn)
作者首先用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)分化成四種神經(jīng)細(xì)胞類型：星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞（圖1a），并通過RT-PCR和功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分化有效性的驗(yàn)證（圖1b-1f）。其次，采用非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)（label free）的方法對(duì)四種類型的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，共鑒定到3206個(gè)蛋白（圖1g），組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種分化神經(jīng)細(xì)胞分別對(duì)應(yīng)的細(xì)胞類型特異性蛋白標(biāo)志物的表達(dá)量均比較高，這進(jìn)一步證明了hiPSC細(xì)胞分化的有效性（圖1h）。

圖1 hiPSC分化及分化有效性確認(rèn)

2. hiPSC分化的神經(jīng)細(xì)胞中分離胞外囊泡并進(jìn)行表征
作者從hiPSC分化的的四種類型的神經(jīng)細(xì)胞中分離胞外囊泡(EV)，使用NTA和TEM方法進(jìn)行表征分析證明EV的純度（圖2a-2c）。針對(duì)胞外囊泡的非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)（label free）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)非EV的蛋白未在EV中檢測到，進(jìn)一步證明了分離的EV的高純度（圖2d-2e）。同時(shí)根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，作者篩選到了16個(gè)在四種分化神經(jīng)細(xì)胞中均同時(shí)表達(dá)的蛋白，即烯醇酶1（ENO1）、熱休克蛋白（HSPA8）、Ras相關(guān)蛋白（RAB7A）、整聯(lián)蛋白ITGB1、膜聯(lián)蛋白(含ANXA1、2、5、6)、基礎(chǔ)免疫球蛋白（BSG）、一類過氧化物酶（含PRDX1、2）、前列腺素F2受體負(fù)調(diào)節(jié)因子（PTGFRN）、皮離蛋白（DCD）、CD59和ACTB、GAPDH（圖2g）。

圖2 hiPSC分化的神經(jīng)細(xì)胞中分離胞外囊泡

3. 神經(jīng)細(xì)胞類型特異性EV蛋白質(zhì)組的比較
為了確定四種神經(jīng)細(xì)胞分離的胞外囊泡蛋白組成的差異，作者比較了囊泡蛋白的豐度，PCA和相關(guān)系數(shù)結(jié)果顯示不同EV蛋白組成具有細(xì)胞類型特異性（圖3a-3b）。根據(jù)聚類分析結(jié)果篩選到了不同細(xì)胞類型特異性的差異表達(dá)EV蛋白（圖3c）,他們參與了不同的生物過程（GO_BP）和KEGG通路（圖3d），如星形膠質(zhì)細(xì)胞特異的EV蛋白主要富集在與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)過程（包括細(xì)胞粘附、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用和整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）以及生物代謝相關(guān)通路（包括糖酵解、丙酮酸代謝過程、膽固醇穩(wěn)態(tài)、氨基酸的生物發(fā)生和碳代謝）。

圖3 hiPSC分化的細(xì)胞類型特異性EV蛋白組的比較分析

4. hiPSC分化的細(xì)胞類型特異性EV中標(biāo)志蛋白的確定
由于EV蛋白在不同的hiPSC分化神經(jīng)細(xì)胞中具有細(xì)胞類型特異性，故作者進(jìn)一步篩選特定的特異性蛋白作為腦源EV的細(xì)胞類型特異性生物標(biāo)記物。通過初步篩選（圖4a-b）和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(圖4c-4d)，最終確定將NCAM1, ATP1A3作為神經(jīng)元EV的標(biāo)志物, LRP1, ITGA6, EAAT1作為星形膠質(zhì)細(xì)胞EV的標(biāo)志物, LCP1作為小膠質(zhì)細(xì)胞EV的標(biāo)志物, LAMP2, FTH1和 MOG 作為少突膠質(zhì)細(xì)胞EV標(biāo)志物。

圖4 細(xì)胞類型特異性EV中標(biāo)志蛋白的鑒定

5. 人類腦組織中分離的胞外囊泡的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
為了加強(qiáng)蛋白組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)以及探索其潛在的臨床應(yīng)用，作者對(duì)30個(gè)人（包括11名健康對(duì)照(HC)、8名輕度認(rèn)知障礙患者(MCI)和11名AD患者）的腦組織EV進(jìn)行了TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)分析（圖5a），共鑒定到4286個(gè)腦源性EV蛋白（其中2645個(gè)為共有蛋白），差異比較分析篩選到242個(gè)顯著改變的蛋白（圖5c）。此外，作者篩選到了多個(gè)疾病特異性差異表達(dá)蛋白，為區(qū)分從HC、MCI和AD大腦中分離出來的EV提供了可能（圖5e）。

圖5 30例人腦組織中分離出的EV的蛋白組學(xué)分析

6. 細(xì)胞類型特異性的EV蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
已知WGCNA(加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析)可用于確定神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的關(guān)鍵分子途徑和潛在治療靶點(diǎn)，作者利用2645個(gè)共有蛋白構(gòu)建了一個(gè)AD EV的WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖6a）并將其與AD的三個(gè)神經(jīng)病理特征（臨床癡呆、斑塊負(fù)荷、神經(jīng)纖維纏結(jié)負(fù)荷）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明M7模塊（與質(zhì)膜的固有成分相關(guān)）與AD病理特征成正相關(guān) (圖6b）。
進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞類型標(biāo)志物在每個(gè)共表達(dá)模塊中的富集情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在M7模塊顯著富集星形膠質(zhì)細(xì)胞EV標(biāo)記物，且與AD性狀顯著正相關(guān)，意味著星形細(xì)胞來源的EV蛋白標(biāo)志物或許可作為AD的生物標(biāo)志物（圖6c）。此外，作者還根據(jù)疾病狀態(tài)測量模塊特征蛋白值預(yù)測可能影響MCI到AD變化的EV蛋白（圖6d）。

圖6 腦源EV蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

7. M7/星形膠質(zhì)細(xì)胞模塊在激活的星形細(xì)胞來源的EV標(biāo)記物中富集，并與AD病理相關(guān)
上述結(jié)果可以看出M7模塊表現(xiàn)出與AD特征（圖6b）和星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的EV的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)（圖6c），作者進(jìn)一步驗(yàn)證了M7模塊是否與激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的EV相關(guān)。結(jié)果顯示M7模塊在有活性的星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的EV中顯著富集（此部分定義為M7/星形膠質(zhì)細(xì)胞模塊）（圖7a），且與前10個(gè)中心蛋白（與AD癥狀相關(guān)）發(fā)生密切的相互作用（圖7b）。此外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證來自M7星形細(xì)胞模塊的EV蛋白是否與AD病理相關(guān)，作者利用IP實(shí)驗(yàn)在5名HC和5名AD患者中驗(yàn)證了活性星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的EV標(biāo)志物與M7模塊中的中心蛋白(ITGB1)的相互作用（圖7e-7g）。上述結(jié)果表明在AD發(fā)病機(jī)制中，M7星形膠質(zhì)細(xì)胞模塊中的EV蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮主導(dǎo)作用，鑒定出的M7 EV蛋白(如ITGB1)，特別是在星形細(xì)胞特異性EV中，可作為潛在的AD生物標(biāo)志物。

圖7 M7模塊在激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的EV標(biāo)記物中富集，并參與AD病理過程

小編小結(jié)
在本研究中，作者使用labelfree非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)方法分析了hiPSC來源的四種不同神經(jīng)細(xì)胞類型(neuron、iAstrocytes、iMGL和iOligos)中分離出的胞外囊泡（EV）的蛋白質(zhì)譜。利用這些獨(dú)特的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集，共鑒定出16種通用蛋白作為新的腦泛EV標(biāo)志物候選蛋白。對(duì)神經(jīng)細(xì)胞類型特異性EV蛋白進(jìn)行表征，這些蛋白可作為腦細(xì)胞類型特異性EV分離的潛在標(biāo)記物。此外作者使用TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)對(duì)AD、MCI和HC腦源性EVs進(jìn)行分析，并結(jié)合WGCNA的方法利用細(xì)胞類型特異性EV蛋白生成了AD腦源性EV蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

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