質粒（Plasmid）是獨立于染色體外的環(huán)狀DNA分子，大小通常在1-200Kb不等，可依賴宿主細胞中的酶和蛋白質進行獨立地復制和轉錄。

　　  質粒是獨立于染色體基因組的DNA。按照質粒的拷貝數量，通常把質粒分嚴緊型質粒和松弛型質粒。嚴緊型質粒：染色體復制一次，質粒也復制一次，每個細菌內只含1-2個質粒；松弛型質粒：當細菌染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細菌內一般含20個左右質�？截�。

　　  為了適應更多復雜的分子克隆實驗，在天然質粒的基礎上，人們構建出具有不同特性的質粒載體。質粒載體通常具有以下幾個特點：具有較小的分子量、可插入較大分子量的目標序列、具有多種常用的限制性內切酶酶切位點，同時具有檢測表型（耐藥性等）。

　　  典型的質粒載體通常具有復制起始點Ori（下方藍色方形）、篩選標記（紅色區(qū)域）以及多克隆酶切位點MCS（右側藍色區(qū)域）

　　  預備知識Ⅱ：分離純化的原理

　　  質粒純化的過程實際上是將質粒與染色體基因組、蛋白質等其他成分分離的過程。在細菌體內，質粒是以共價閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)的形式存在。堿裂解法是實驗室提取質粒最常用的方法之一，該方法的原理是利用線性的染色體DNA與閉合環(huán)狀質粒DNA在拓撲學上的差異來實現分離。

　　  共價閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)結構示意圖，在細菌中，cccDNA通常以超螺旋的形式存在

　　  實驗操作中，我們通常應用溶菌酶和陰離子表面按活性劑SDS（十二烷基磺酸鈉）來處理收集到的菌體。在溶菌酶的作用下，細菌的細胞壁破裂并釋放出質粒。在pH12-12.5這個狹窄的范圍內，線性染色體DNA的雙螺旋會解開，質粒DNA的氫鍵也會斷裂。然而，質粒DNA的氫鍵雖然斷裂，但兩條鏈依然互補纏繞，緊密結合。在裂解過程中，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，SDS可包被在這些大型復合物表面上。當加入乙酸甲使溶液恢復中性時，兩種DNA均可迅速復性，但是復性的精準度有所差別：cccDNA由于互補鏈在形體上始終保持在一起，復性迅速而準確。隨機斷裂的線性DNA彼此分離，復性既不迅速也不準確，會聚集成網狀結構。通過離心，染色體DNA會與細胞碎片一起被沉淀下來，而質粒DNA會留在上清液中。再用異丙醇或乙醇洗滌，會得到比較純的質粒DNA。

　　  質粒提取與純化操作指南

　　  質粒的提取和純化主要包含三個步驟：①培養(yǎng)細菌，擴增質粒；②收集并裂解細菌；③分離并純化質粒。目前，試劑廠商已經開發(fā)出多種多樣的商品化DNA提取試劑盒，這些試劑盒中幾乎都包含三種基本的溶液：溶液Ⅰ（葡萄糖、Tris·Cl(pH8.0)、EDTA(pH8.0)）、溶液Ⅱ（NaOH，1%SDS）和溶液Ⅲ這三種溶液分別起到懸浮菌體、破碎細胞以及中和的作用。實驗中一般會使用異丙醇沉淀質粒，70%的乙醇洗滌質粒。提取好的質粒的可以保存在含有RNA酶的TE緩沖液中。