一、細(xì)胞簡(jiǎn)介：

細(xì)胞名稱：人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞MEG-01/(STR鑒定正確）

智立編碼：20211259101220138

MEG-01人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞源自一位CML患者成巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)換期的骨髓細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)因子VIII和表面球蛋白IIb/IIIa，高碘酸-Schiff(PAS)反應(yīng)，α醋酸萘酯酶和酸性磷酸酶陽(yáng)性。髓過(guò)氧化物酶，α丁酸萘酯酶，氯化醋酸AS-D萘苯酚酯酶和堿性磷酸酶陰性。用單克隆抗體BA-1(抗B細(xì)胞，粒性白細(xì)胞)，HPL-3(抗球蛋白IIb/IIIa)和20.3(抗單核細(xì)胞，血小板)染色成陽(yáng)性。其他淋巴和骨髓類抗體成陰性。

二、培養(yǎng)步驟

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

三、應(yīng)用

用于MicroRNA-223調(diào)控急性缺血性卒中患者氯吡格雷治療后血小板反應(yīng)性的機(jī)制研究：

通過(guò)建立氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?使得氯吡格雷可以直接在體外完成代謝活化并進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn),并利用該細(xì)胞模型相關(guān)實(shí)驗(yàn)與相關(guān)臨床研究,對(duì)氯吡格雷治療低反應(yīng)的機(jī)制的進(jìn)行了更深一步的探討。

MicroRNA-223與急性缺血性卒中患者血小板ADP受體P2Y12和氯吡格雷反應(yīng)性的相關(guān)性分析目的：探討急性缺血性卒中患者氯吡格雷治療前后血小板膜蛋白P2Y12表達(dá)水平與血小板反應(yīng)性的關(guān)系,以及miR-223在其中的調(diào)控作用。方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性缺血性卒中患者治療前后ADP誘導(dǎo)血小板聚集率,通過(guò)血小板相對(duì)抑制率及八分位數(shù)法篩選出低反應(yīng)組和高反應(yīng)組,檢測(cè)極端病例治療前后血小板中P2Y12蛋白表達(dá)水平,并比較分析其在兩組極端病例中的差異;構(gòu)建病毒載體感染人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞MEG-01,下調(diào)miR-223水平,觀察靶基因P2Y12蛋白及mRNA水平表達(dá)變化。

結(jié)果：在急性缺血性卒中患者中,無(wú)論在治療前水平還是治療后水平,血小板P2Y12的蛋白表達(dá)水平與血小板聚集率均呈顯著正相關(guān)（p<0.05）。高反應(yīng)組治療后較治療前P2Y12蛋白表達(dá)水平有所降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.073）。

低反應(yīng)組治療前后血小板P2Y12蛋白表達(dá)的改變程度較高反應(yīng)組顯著減低（1.14604vs0.77097,p=0.031）。通過(guò)構(gòu)建病毒載體感染下調(diào)MEG-01細(xì)胞中miR-223水平,可以顯著升高P2Y12mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。

結(jié)論：氯吡格雷低反應(yīng)組治療前后血小板P2Y12蛋白表達(dá)的相對(duì)降低程度較高反應(yīng)組顯著減低;在人血小板前體細(xì)胞中,miR-223可以調(diào)控ADP受體蛋白P2Y12的表達(dá)。

氯吡格雷肝微粒體孵育液處理人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞模型的建立及其對(duì)miR-223表達(dá)的影響目的:建立氯吡格雷肝微粒孵育液處理人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞MEG-01的細(xì)胞處理模型,并探討氯吡格雷孵育液處理對(duì)miR-223表達(dá)所產(chǎn)生的影響,為從細(xì)胞水平探索氯吡格雷治療對(duì)人體血小板所產(chǎn)生影響提供新的方法學(xué)依據(jù)。

方法：利用毒理學(xué)研究方法,以肝微粒體和氯吡格雷在適宜體系條件下共同孵育,獲得含有氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物的孵育液。觀察不同濃度梯度和不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細(xì)胞后P2Y12蛋白水平的表達(dá)變化,確定細(xì)胞模型最佳處理濃度和時(shí)間,觀察細(xì)胞中miR-223表達(dá)變化。

結(jié)果：在低（100ul/2ml）、高（200ul/2ml）兩種濃度下氯吡格雷孵育液處理MEG-01細(xì)胞后,P2Y12蛋白表達(dá)均無(wú)顯著變化（p>0.05）。在以200ul/2ml的濃度連續(xù)處理5天的條件下,氯吡格雷孵育液組細(xì)胞膜P2Y12蛋白表達(dá)較對(duì)照肝微粒體孵育液組顯著降低42.6%（p<0.01）。在以200ul/2ml的濃度分別連續(xù)處理3天、5天后,氯吡格雷孵育液處理的MEG-01細(xì)胞中miR-223表達(dá)分別下降了47.3%和32%（p值均<0.05）。