原代細胞的培養(yǎng)步驟

一、靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求

1、細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性；

2、細胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L；

3、培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng)；

4、小牛血清濃度為10%-80%；

5、應(yīng)在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

6、在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落，漂�。�

7、待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細胞換液；

8、用骨髓或外周血中的懸浮細胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時，應(yīng)將細胞懸液經(jīng)低速離心后換液。

二、懸浮細胞的培養(yǎng)要求

1、原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細胞；

2、短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進行；

3、細胞濃度可在5-8×109/L范圍內(nèi)進行分瓶試驗；

4、長期培養(yǎng)時，淋巴細胞中要加入生長因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細胞生長；

5、細胞換液一般每隔3天需半量換液一次；

6、細胞傳代一般待細胞增殖加快、細胞密度較高時才能進行。

三、原代細胞的維持

1、貼壁細胞長成網(wǎng)狀或基本單層時，未達到飽和密度，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細胞繼續(xù)生長繁殖的需要；

2、換入等量完全培養(yǎng)基或換成含2%小牛血清的維持液；

3、懸浮細胞細胞培養(yǎng)基中不僅會發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細胞的營養(yǎng)需求，需進行換液。通常采用半量換液的方法；

四、原代細胞培養(yǎng)的首次傳代

原代培養(yǎng)后由于懸浮細胞增殖，數(shù)量增加甚至達飽和密度；貼壁細胞的相互匯合，使整個瓶底逐漸被細胞覆蓋，細胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。

首次傳代應(yīng)注意以下幾點：

(1)細胞生長密度不高時，不能急于傳代。

(2)原代培養(yǎng)的貼壁細胞需控制消化時間。

(3)吹打已消化的細胞應(yīng)減少機械損傷。

(4)首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些。

(5)首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些。小牛血清濃度可加大至15%～20%左右。

一、懸浮細胞的分離方法

1、將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉(zhuǎn)至離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

2、去掉上清，離心沉淀用無鈣、鎂的PBS清洗后1000rpm/分鐘離心5分鐘。此步重復(fù)兩次。

3、用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整適當(dāng)細胞濃度后分瓶培養(yǎng)。

4、如選用懸液中某種細胞，可采用離心后的細胞分層液收獲目的細胞。

二、實體組織材料的分離方法

（一）機械分散法

1、纖維成分很少的腦組織，部分胚胎組織，用剪刀剪碎至1mm3的組織塊。

2、用PBS清洗兩次后

①用吸管吹打，分散組織細胞。

②或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細胞通過針頭壓出。

③或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物（注射器鈍端）壓擠使細胞從網(wǎng)孔中壓擠出。

3、收集細胞轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

4、去上清，加入含血清的培養(yǎng)基，重懸后移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

（二）消化分離法

1、酶消化分離法（過夜冷消化法）

①細胞間質(zhì)較少的軟組織，如肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等，用Hanks液清洗組織三次，剪成碎塊大小為4毫米左右。

②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪組織。

③加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過夜。

④次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2-3次。

⑤加入少量含血清的培養(yǎng)基吹打分散，細胞計數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。

2、非酶消化法（EDTA消化法）

①把組織塊剪碎，呈1mm3大小的組織塊。

②將碎組織塊在平皿中用無鈣鎂PBS洗2-3次。

③加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當(dāng)時間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。

④棄去上清，加入含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基中止消化反應(yīng)，并洗滌2-3次后，加入完全培養(yǎng)基。

⑤用吸管吹打，使細胞充分散開后用紗網(wǎng)過濾后分瓶培養(yǎng)。

（三）原代細胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細胞進行培養(yǎng)。由于細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段，同時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。利用此方法還可直接服務(wù)于臨床實踐。例如，用從手術(shù)中切除的腫瘤細胞進行原代培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)細胞進行抗癌藥物的篩選，根據(jù)腫瘤細胞對加入的化療藥物的敏感性來幫助選擇最有效的化療方案，有可能起到增強療效、降低副作用的作用。

（四）原代細胞的傳代、保存

（1）傳代：依椐細胞的生長狀態(tài)，生長的細胞1：2或1：3進行傳代。

（2）保存：DMSO＋培養(yǎng)液＋血清

按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→超低溫冰箱（－80℃過夜）→液氮。

（五）原代細胞的復(fù)蘇

（1）取出細胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。

（2）吸出細胞懸液，并加10倍以上培養(yǎng)液。

（3）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種培養(yǎng)瓶，放入37℃CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。