原位雜交（in situ hybridization）是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程�；�本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子的特點，應(yīng)用帶有標(biāo)記的（放射性同位素、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)）DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸（RNA或DNA）片段進行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在并定位。
 

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種原位雜交方法。因為不需要放射性同位素標(biāo)記，因此經(jīng)濟安全；還可以通過不同標(biāo)記的探針，在同一個樣品中同時檢測多種序列。
 

熒光原位雜交探針的熒光標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用熒光素親和素或者鏈霉親和素進行檢測，同時還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號進行放大；直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法檢測步驟簡單，但由于不能進行信號放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。
 

原位雜交探針分類

1. 染色體特異重復(fù)序列探針，主要用于檢測染色體數(shù)目異常；

2. 全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，主要用于檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常；

3. 特異性位置探針，用于檢測染色體的易位、缺失等。此外，還有用于特定RNA檢測的人工合成或體外轉(zhuǎn)錄的探針。

熒光原位雜交實驗的步驟

1. 探針變性：將探針在75℃恒溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

2. 切片置于65℃下過夜烘烤。

3. 二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10分鐘，隨后浸入100%乙醇中5分鐘。

4. 切片依次室溫置于100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各兩分鐘復(fù)水。將組織切片室溫浸入去離子水中3分鐘，用無絨紙巾吸取多余的水分。

5. 50℃下用30%酸性亞硫酸鈉（sodium bisulfite ）處理組織切片20－30分鐘。

6. 于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。

7. 取0.4ml蛋白酶K儲存液（20mg/ml）溶于40ml 20XSSC(pH 7.0)得到蛋白酶K工作液（200µg/ml）；將組織切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下孵育20-30分鐘。

8. 組織切片經(jīng)蛋白酶K消化后，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。

9. 將組織切片置于0.1M HCl中室溫浸泡5-10分鐘，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。

10. 將組織切片玻片依次置于-20℃預(yù)冷的70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分鐘脫水。

11. 將組織切片室溫浸入丙酮溶液中2分鐘。

12. 自然干燥玻片，加熱玻片至56℃。

13. 將已變性或預(yù)退火的探針10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交過夜（為防止雜交液蒸發(fā)，此過程在濕盒中進行）。

14. 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分數(shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5 min。

15. 在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5 min。

16. 自然干燥玻片，DAPI復(fù)染。

17. 熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

    

     

    

                                                             乳腺癌HER2基因擴增檢測
                                                 （綠色：染色體著色絲粒，紅色：HER2)

    

    circRNA熒光原位雜交