從濾光片轉(zhuǎn)輪到聲光可調(diào)濾光器（AOTF）
熒光的激發(fā)需要特定顏色的光：既要有效地激發(fā)探針（波長(zhǎng)接近探針激發(fā)光譜的最大值），又要留下足夠的空間收集發(fā)射光而不會(huì)進(jìn)入檢測(cè)器的光路中。在共聚焦顯微鏡中，通常使用多譜線(xiàn)激光器或激光電池作為激發(fā)光源，這需要設(shè)備既能夠自由選擇適合當(dāng)前實(shí)驗(yàn)所用熒光團(tuán)的激發(fā)譜線(xiàn)又能夠控制該激發(fā)譜線(xiàn)的強(qiáng)度因?yàn)橹苯釉诠庠刺幙刂茝?qiáng)度時(shí)，大多數(shù)激光器會(huì)出現(xiàn)噪音增強(qiáng)的現(xiàn)象。AOTF（聲光可調(diào)濾光器）的引入簡(jiǎn)化了濾光過(guò)程，同時(shí)顯著提高了實(shí)驗(yàn)的靈活性。AOTF對(duì)于耦合白激光源是唯一的明智選擇。

濾光片轉(zhuǎn)輪-早期的濾光工具
共聚焦顯微鏡中熒光的激發(fā)光源是激光或不同顏色的激光組合。出于技術(shù)原因共聚焦選擇激光作為光源[2]。但是傳統(tǒng)激光器通常只發(fā)射一條或幾條單一波長(zhǎng)的激光譜線(xiàn)（現(xiàn)代化解決方案是白光激光器[3]）。然而，生物醫(yī)學(xué)成像所使用的熒光染料的激發(fā)光譜從近紫外到近紅外的都有。大多數(shù)情況下，為了同時(shí)檢測(cè)幾種不同熒光染料的發(fā)射情況，需要通過(guò)二向色鏡結(jié)合一系列激光譜線(xiàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，與在熒光照明中分離激發(fā)和發(fā)射光的“分光鏡”相比，反射鏡以反向模式使用。

由于通常激光器的低頻噪聲頻帶相對(duì)較窄，因此不建議直接通過(guò)激光功率控制強(qiáng)度。因此，需要一種設(shè)備來(lái)單獨(dú)減弱激光強(qiáng)度。同樣，如果關(guān)閉和打開(kāi)光源次數(shù)過(guò)多，激光器壽命也會(huì)縮短。特別是氣體激光器，在關(guān)閉后仍處于高溫狀態(tài)而未冷卻時(shí)，不適合馬上再次開(kāi)啟。

“激光電池”滿(mǎn)足以上所有要求，它由一系列激光器（通常為3-5個(gè)）組成。所有激光器均配有光閘，光閘由機(jī)電驅(qū)動(dòng)并由軟件控制。所有激光器都需要一個(gè)用于減弱強(qiáng)度的伺服控制設(shè)備（一個(gè)帶有一系列灰度濾片濾光片轉(zhuǎn)輪或滑塊）多譜線(xiàn)激光器還需要另一個(gè)濾光片轉(zhuǎn)輪或滑塊，它包含一系列邊緣濾片和帶通濾片，以便選擇單譜線(xiàn)或組合譜線(xiàn)。

顯然，整個(gè)設(shè)置可能會(huì)變得略微復(fù)雜低效，容易出現(xiàn)錯(cuò)位和漂移問(wèn)題，可能在濾片選擇切換過(guò)程中引發(fā)機(jī)械振動(dòng)。若改變激發(fā)方案，成像的效率將非常低下，由于安裝在濾光輪或滑塊上的濾光片數(shù)量有限，該設(shè)備靈活度不高。

 
圖1：傳統(tǒng)的“激光電池”帶有5個(gè)激光管、5個(gè)機(jī)械光閘、8個(gè)光束組合鏡、5個(gè)衰減濾光片轉(zhuǎn)輪和1個(gè)用于多參數(shù)共聚焦顯微鏡的選擇激發(fā)譜線(xiàn)濾光片轉(zhuǎn)輪。

聲光可調(diào)濾光器-運(yùn)行方式
簡(jiǎn)化機(jī)械設(shè)置并將靈活性提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)的一個(gè)重要步驟是采用聲光可調(diào)濾光器（AOTF）。AOTF是一種可以控制所需顏色的光指向一個(gè)不同的方向的設(shè)備，而其余顏色的光直接通過(guò) AOTF [1]。AOTF由晶體制成，通常是TeO₂或SiO₂或其他具有類(lèi)似特性的化合物。晶體由機(jī)械轉(zhuǎn)換器在幾百兆赫范圍內(nèi)的機(jī)械波激發(fā)（聲光可調(diào)濾光器的“聲”是指機(jī)械波，盡管頻率不符合人耳可聽(tīng)見(jiàn)聲音的頻率）。最重要的是所需光束偏轉(zhuǎn)的方向是固定的，不會(huì)隨光的顏色而改變。此外，指定方向的進(jìn)光量也可以通過(guò)機(jī)械波的振幅進(jìn)行控制。

激光電池發(fā)射出不同波長(zhǎng)的激光譜線(xiàn)（準(zhǔn)直）后，AOTF可以選擇任意波長(zhǎng)的譜線(xiàn)使之偏轉(zhuǎn)至所需方向，并可控制該譜線(xiàn)的能量。AOTF可以真正同時(shí)選擇多條譜線(xiàn)，譜線(xiàn)數(shù)量主要取決于采購(gòu)設(shè)備具體情況。一個(gè)好的系統(tǒng)可同時(shí)提供8條譜線(xiàn)。

總而言之，AOTF用機(jī)械固定的單晶完全取代了上述所有快門(mén)、衰減濾片和譜線(xiàn)選擇濾片，可以輕松實(shí)現(xiàn)任意譜線(xiàn)的組合；當(dāng)激光電池同時(shí)提供8條譜線(xiàn)時(shí)，組合方式達(dá)到256種——這對(duì)于AOTF來(lái)說(shuō)不是問(wèn)題。另外：每條選定的譜線(xiàn)在強(qiáng)度上都是無(wú)級(jí)可控的。本質(zhì)上，AOTF是一個(gè)“8-通道激光調(diào)光器”。
工程師可能會(huì)認(rèn)為，AOTF將兩種偏振模式導(dǎo)向不同的方向。這是完全正確的，并不損害概念。無(wú)論如何，激光都是偏振光，因此光將始終指向既定方向。垂直方向無(wú)激光，沒(méi)有任何指向。

 
圖2：在以傳統(tǒng)激光電池為光源的共聚焦照明中，AOTF（右邊的方框）替換了所有快門(mén)、衰減濾片和譜線(xiàn)選擇濾片，任何進(jìn)入AOTF的譜線(xiàn)都可以得到抑制、衰減或完全用于共聚焦顯微鏡。由激光器發(fā)射的任意譜線(xiàn)都可進(jìn)行組合（組合數(shù)量大但有限）。
 
AOTF-額外的好處
 
圖3：用不同激光譜線(xiàn)或不同強(qiáng)度的同一條激光譜線(xiàn)掃描感興趣的區(qū)域。在激光譜線(xiàn)掃描期間，照明方式會(huì)根據(jù)預(yù)定義的模式在預(yù)設(shè)點(diǎn)發(fā)生變化。任何組合都是可能的，幾乎所有圖形都可以使用鼠標(biāo)在預(yù)掃描的圖像上繪制。當(dāng)然，也可應(yīng)用幾何圖案（矩形、圓形、橢圓形……）。“零線(xiàn)”也是一種模式，常用于保護(hù)細(xì)胞培養(yǎng)物中的背景細(xì)胞。
 
聲光分束器可在特定樣本中進(jìn)行任一符合熒光染料組成的激光組合。除此以外，假設(shè)用兩種不同的熒光染料對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，一種非常強(qiáng)，另一種非常弱，而無(wú)級(jí)調(diào)諧通過(guò)調(diào)暗明亮染料的激發(fā)來(lái)檢測(cè)強(qiáng)度相似的兩種熒光，可以平衡熒光發(fā)射強(qiáng)度。因?yàn)锳OTF的控制速度很快，不需要停止掃描過(guò)程，所以很容易在成像過(guò)程中即時(shí)實(shí)現(xiàn)， 通過(guò)無(wú)級(jí)控制來(lái)平衡激發(fā)光強(qiáng)度，不僅有利于對(duì)比熒光通道，而且還是改善熒光染料光譜拆分的利器。許多染料的發(fā)射光譜出現(xiàn)“拖尾”現(xiàn)象，導(dǎo)致在成像的通道收集了錯(cuò)誤的信號(hào)。通過(guò)將激發(fā)降至最低，可以改善發(fā)射光譜的拆分（抑制串色）。
 
最后，選定譜線(xiàn)的波長(zhǎng)（和強(qiáng)度）之間的切換在幾微秒內(nèi)完成，速度非常快；相比之下，機(jī)械標(biāo)準(zhǔn)濾光片轉(zhuǎn)輪大約需要一秒鐘。這種快速切換使得在單條譜線(xiàn)的掃描期間可以改變激發(fā)方式（采用何種波長(zhǎng)的譜線(xiàn)，這些譜線(xiàn)分別對(duì)應(yīng)多大強(qiáng)度）。此功能可在樣本上繪制用不同激發(fā)光激發(fā)的區(qū)域，即所謂的“感興趣區(qū)域”，在這些區(qū)域中，不同的激光被激活用于成像。此外，無(wú)需采集信號(hào)的區(qū)域不會(huì)被照射，非常好地保護(hù)了樣本以供日后研究。本文開(kāi)頭的圖片展示了這類(lèi)感興趣區(qū)域，在單次掃描中應(yīng)用了5種不同的參數(shù)設(shè)置。

最后，如果選擇白光激光器作為光源，AOTF可以選擇白激光中任何可用的顏色。在此情況下，聲光可調(diào)濾光器將白激光光源變成可調(diào)光源。


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