共聚焦成像的光學切片要求在光路發(fā)射部分的場共軛平面上有一個小孔。在最簡單的情況下，這個孔徑為圓形，允許透射出照亮孔徑的艾里衍射圖案的中心部分�？讖酱笮�應該剛好可以通過該圖案（“艾里斑”）的內圈。因此，孔徑的正確大小取決于波長和物鏡的數(shù)值孔徑，因為這些參數(shù)也定義了中間像平面中的（放大）衍射圖案。

為了適應不同的顏色和分辨率，檢測針孔應該可變。要獲得精確的圓形孔徑，這意味著在機械設備上提供一組孔徑，以便在需要時可以改變大小。大多數(shù)共聚焦顯微鏡使用一種可調諧針孔代替，通常為雙葉片“虹膜”。因此，孔徑不是圓形，而是矩形（正方形）。

有人認為，六角形針孔（使用三枚葉片）在傳遞焦點信息方面會更有效，因為它可以覆蓋較大部分的圓形[1,2]。

不同幾何形狀的面積
可以通過孔徑的光量顯然取決于孔徑本身的大小。舉例來說，對于圓形孔徑，如果半徑增加，就會透射更多光線。然后，該透光量取決于由半徑r定義的面積A_c：
 
如果孔徑為方形，則面積A_s的計算取決于邊長a：
 
最后，通過邊長s給出六邊形的面積A_h：
 

所有這些計算只需具備中學知識即可。然而，如何比較不同尺寸并無明確規(guī)定：例如，你可以比較內接于圓形的六邊形。這種情況下，這些面積的比率為A_c：A_h：A_s = 100：83：64。正方形的面積比六邊形小大約30%。這一結果被用來證明使用六邊形孔徑時，與正方形光圈相比，“亮度提高了30%”。這一聲明來自官方，甚至出現(xiàn)在公開網站上。

同樣的，人們可以使用帶內接圓形的多邊形比較。這種情況，這些面積的比率為A_c：A_h：A_s = 100：110：127，由此我們可以得出結論，使用方形孔徑時，亮度可以提高大約15%。

很明顯，這兩種論述在科學上都站不住腳，會讓讀者陷入迷惑，當然這可能就是這種陳述的目的。

由于通過孔徑的光量取決于面積，因此比較不同尺寸的正確參數(shù)是各種幾何形狀的面積。通過非常簡單的數(shù)據(jù)運算，你可以知道：
 

必須要獲得面積與半徑為r的圓形孔徑相同的多邊形。這一共識在1980年代末就被共聚焦社區(qū)所認同（因為這是唯一明智的做法）。

因此，如果正確比較，不同幾何形狀的孔徑將傳輸相同的光量，并且光線分布均勻。
  圖1：用于比較不同幾何形狀孔徑的選項左：內接于圓的多邊形。多邊形的角越多，面積就越大。右：內接于多邊形的圓多邊形的角越多，面積就越小。正確的方法顯示在中間：計算多邊形的邊長，使多邊形面積與圓面積相同。

針孔卷積與PSF
事實上，投射到針孔的光強分布并不均勻，而是由艾里衍射圖案確定。為了找出實際的透光效率，必須將不同幾何形狀和大小孔徑同艾里圖案疊加在一起。例如，圓形和方形針孔需要進行此等操作，其中的獨立參數(shù)是長度v_d，該長度v_d默認根據(jù)圓形半徑調整，以便產生相同的面積[3]

我們計算了艾里圖案通過各種幾何形狀和大小的孔徑時的光量，以研究其與面積本身的函數(shù)關系，這樣更易理解并能進行適當?shù)谋容^。最簡單的情況是與圓形孔徑的依賴關系，它能夠整合進來的（固定的）艾里圖案的強度分布：
 

以計算多邊形孔徑的強度分布，并用數(shù)值方法進行疊加。

圖2清晰表明，至少對于圓形和等邊多邊形，焦距強度與幾何形狀完全無關。差異在大約2%的范圍內變化，六邊形分布在圓形和正方形之間，與預期相同。

因此，關于檢測針孔形狀的焦平面信號傳輸效率（在（1）中稱為“亮度”）的任何結論均沒有任何意義。如果存在差異，則說明比較參數(shù)選擇錯誤。
  圖2：通過不同形狀和大小的孔徑傳輸信號的比較。目前使用的幾何形狀包括圓形、方形和六邊形。當用艾里圖案計算照明時，所有幾何形狀都顯示出幾乎相同的對大小的依賴關系，而該大小由孔徑面積決定。

光譜共聚焦中的針孔幾何形狀
如上所示，正多邊形的邊數(shù)對聚焦信號的傳輸沒有影響。沒有理由假設對散焦信號也是如此。因此，看起來圓形、方形和六邊形針孔在性能上相同。對于基于濾光片的經典共聚焦顯微鏡來說，這可能是一個合理的結論。用于使用色散元件作為不同發(fā)射帶的分離器件的共聚焦顯微鏡時，存在差異。

對于含有色散元件的裝置，其光譜分辨率不僅取決于元件本身的性能，還取決于入射光束的尺寸和幾何形狀。顯然，較大的光束直徑會降低光譜分辨率。我們把記錄光譜的中間像平面（光度計滑塊的位置等）稱為光譜平面。較大的物體會在光譜平面上造成較大的圖像。在光譜平面中的任何給定位置，若物體尺寸較大，更多的顏色將有助于局部強度。因此，光譜探測的一個固有結果是光譜分辨率依賴于針孔大小，因為針孔在光譜平面上成像！

因此，光譜平面中圖像的幾何形狀是針孔（放大后）的衍射圖樣。這些衍射圖案的差別很大，取決于幾何形狀。圓形孔徑會引起眾所周知的艾里圖案，它旋轉對稱。針孔在光譜平面中旋轉不會引起差異。正方形的衍射圖樣并非旋轉對稱，其特征是在邊緣有強烈的波瓣，而強度會由內向外大幅下降。這種效應用來提高共聚焦掃描顯微鏡的光譜分辨率[4]：當針孔在光譜平面內旋轉45°時，中心盤外的大部分光強會被引離探測范圍。光譜平面上的顏色重疊就會大幅減少——在本例中減少了1.5倍。

在使用六邊形針孔的系統(tǒng)中，這種影響要小得多，增益可以忽略不計。

因此，最佳的光譜共聚焦裝置采用一個正確定向的方形針孔。
  圖3：利用相對于色散方向旋轉45°的正方形針孔繪制光路設計圖。這種組合優(yōu)化了固有的光譜分辨率——任何其他幾何形狀都會損害光譜性能。
相關鏈接：熒光、活細胞成像、類器官和 3D 細胞培養(yǎng)、超高分辨率顯微鏡和納米顯微鏡、癌癥研究、細胞生物學研究、熒光壽命成像、模式生物研究、光操作、病毒學、斑馬魚研究
 
了解更多：徠卡顯微