基因治療是通過(guò)將修飾的基因傳遞至靶細(xì)胞中,從而把患者體內(nèi)的突變基因替換為相對(duì)應(yīng)的健康基因拷貝來(lái)實(shí)現(xiàn)治療或者預(yù)防疾病的目的。與傳統(tǒng)的藥物治療相比,基因治療是從根本上對(duì)疾病進(jìn)行控制,所以有著非常好的發(fā)展前景,在世界范圍內(nèi)得到越來(lái)越多醫(yī)藥行業(yè)的關(guān)注和投入。
將正;颍ㄍ庠矗⿲(dǎo)入生物細(xì)胞內(nèi)必須借助一定的技術(shù)方法或載體,基因轉(zhuǎn)移的方法分為生物學(xué)方法、物理方法和化學(xué)方法。
病毒越來(lái)越多的用作載體,用于傳遞基因治療的遺傳物質(zhì)和疫苗應(yīng)用。重組腺相關(guān)病毒(recombinant Adeno-Associated Viruses, rAAV)是基因治療最為常用的病毒載體之一。
一、如何開發(fā)高效安全的 rAAV 療法?
為了開發(fā)通過(guò)受控和經(jīng)濟(jì)的制造工藝生產(chǎn)的高效的 rAAV 療法,需要解決從病毒衣殼設(shè)計(jì)到確定最佳工藝和配方條件,再到全面質(zhì)量控制的多重挑戰(zhàn)。應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn),需要針對(duì) rAAV 樣品下列屬性進(jìn)行量身定制的分析表征:
Ø 測(cè)定衣殼蛋白或者顆粒滴度(capsidor particle titer)
Ø 完整 rAAV 顆粒的百分比
Ø 空-載比(Full-empty ratio)
Ø 顆粒的粒徑
Ø 聚集體形成(aggregate formation)
Ø 熱穩(wěn)定性(Thermal stability)
Ø 基因組釋放(genome release)
Ø 衣殼電荷(capsid charge)等
而所有這些都可能影響最終產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)。
通常,rAAV 滴度和病毒載量是使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)、液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ddPCR)、分析超速離心(AUC)和電子顯微鏡(EM)的技術(shù)組合測(cè)定的。這些方法通常既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力,而且其準(zhǔn)確性和精確性也值得懷疑[1]。因此,業(yè)內(nèi)越來(lái)越需求一種不依賴于使用專用試劑和昂貴的參考標(biāo)準(zhǔn)品的快速分析解決方案。
動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、多角度動(dòng)態(tài)光散射(MADLS)、電泳光散射(ELS)、尺寸排阻色譜-多角度光散射(SEC-MALS)、納米顆粒跟蹤技術(shù)(NTA)、等溫滴定量熱法(ITC)和差式掃描量熱法(DSC)可以提供有關(guān)病毒載體的關(guān)鍵分析和質(zhì)量屬性的重要信息,從而能夠?qū)Χ喾N參數(shù)進(jìn)行表征、比較和優(yōu)化。
樣品關(guān)鍵參數(shù) |
馬爾文帕納科的技術(shù)方案 |
衣殼蛋白尺寸 |
DLS、NTA |
衣殼蛋白及轉(zhuǎn)基因 的絕對(duì)分子量 |
SEC-MALS (OMNISEC) |
衣殼滴度或顆粒計(jì)數(shù) |
MADLS, SEC-MALS (OMNISEC), NTA |
含基因病毒顆粒百分比分析 |
SEC-MALS (OMNISEC) |
聚集形成分析 |
DLS, MADLS, SEC-MALS (OMNISEC), NTA |
碎片化分析 |
SEC-MALS (OMNISEC) |
熱穩(wěn)定性分析 |
DLS, DSC |
高級(jí)結(jié)構(gòu)分析 |
DSC |
血清型鑒定 |
DSC |
衣殼解聚及基因組注入 |
DLS, DSC |
衣殼蛋白尺寸 |
ITC |
電荷分析 |
ELS |
表1 總結(jié)了病毒載體研究中各種重要的關(guān)鍵屬性(CQA),以及馬爾文帕納科可以對(duì)應(yīng)提供表征此類信息的各項(xiàng)技術(shù)。
DLS、MADLS、SEC-MALS、NTA、ITC和DSC屬于無(wú)標(biāo)記的生物物理技術(shù),需要最少程度的方法開發(fā),并且可以很容易的應(yīng)用于各個(gè)階段,強(qiáng)化了基因治療開發(fā)的分析工作流程。
二、高效的表征技術(shù)概念解讀
動(dòng)態(tài)光散射(DLS)
動(dòng)態(tài)光散射(DLS)是一種非侵入式技術(shù),可以測(cè)量由顆粒分散體系或分子溶液引起的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間的波動(dòng)。由于進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的顆粒或者分子的隨機(jī)運(yùn)動(dòng),散射光的強(qiáng)度會(huì)隨之發(fā)生波動(dòng)。使用自相關(guān)算法分析這些強(qiáng)度波動(dòng)可以確定平移擴(kuò)散系數(shù),隨后根據(jù)斯托克斯-愛因斯坦方程確定流體力學(xué)尺寸。
多角度動(dòng)態(tài)光散射(MADLS)
多角度動(dòng)態(tài)光散射(MADLS)通過(guò)使用三個(gè)不同的檢測(cè)角度(背面、側(cè)面和正面)并將獲取的光散射信息組合成一個(gè)與角度無(wú)關(guān)(Angular-Independent)的粒徑分布,從而可以對(duì)多模態(tài)的樣品進(jìn)行更高分辨率的尺寸測(cè)定。應(yīng)用MADLS技術(shù)的擴(kuò)展還可以測(cè)量出顆粒濃度(Concentration)。
電泳光散射(ELS)
電泳光散射(ELS)測(cè)定來(lái)自在電場(chǎng)中進(jìn)行電泳的顆粒或者分子的散射光的頻移(Frequency Shift),并能夠計(jì)算出Zeta電位。顆粒的Zeta電位是顆粒在特定介質(zhì)中獲得的總電荷,可用于預(yù)測(cè)分散體系的穩(wěn)定性并深入了解所研究的顆粒的表面化學(xué)。
尺寸排阻色譜(SEC)
尺寸排阻色譜(SEC)是一種分離技術(shù),可根據(jù)分子進(jìn)出柱中多孔凝膠基質(zhì)的流體力學(xué)半徑來(lái)分離分子。搭配一系列先進(jìn)的檢測(cè)器,如光散射(LS)、UV、RI和粘度,可以測(cè)量絕對(duì)分子量、分子大小、特征粘度、支化和其他參數(shù)。
差式掃描量熱法(DSC)
差式掃描量熱法(DSC)是一種直接分析天然蛋白質(zhì)或其他生物分子熱穩(wěn)定性的技術(shù),無(wú)需外在熒光素或者內(nèi)源熒光,它通過(guò)測(cè)定在恒定的升溫速率下使生物分子發(fā)生熱變性過(guò)程中的熱容變化來(lái)實(shí)現(xiàn)。
案例研究 | 綜合使用多種技術(shù)表征 rAAV性狀:衣殼分子量、聚集狀態(tài)、滴度、穩(wěn)定性……
1,空 rAAV5 衣殼分析
SEC-MALS (OMNI-SEC)測(cè)量產(chǎn)生的關(guān)鍵數(shù)據(jù)是絕對(duì)分子量,與柱保留時(shí)間或用于校準(zhǔn)系統(tǒng)的任何標(biāo)準(zhǔn)無(wú)關(guān)。在空rAAV的情況下(Fig.1 和表2),主要單體的Mw為3.84 x 106 g/mol?找職さ鞍椎睦碚摲肿恿繛3.8 x 106 g/mol,證實(shí)該分析結(jié)果符合預(yù)期。
圖1 rAAV5 空殼三重色譜圖
表2 rAAV5空殼的定量參數(shù)
Mw/Mn 描述樣品的分散性,接近1的值表示峰中有單個(gè)群體,遠(yuǎn)高于1的值表示峰內(nèi)有多個(gè)群體。在空 rAAV 的情況下,單體和二聚體的 Mw/Mn 值接近1,表明是單一群體。聚集體和碎片 Mw/Mn 值顯著高于1,表明單個(gè)峰內(nèi)具有不同分子量的多個(gè)群體(表2)。
樣品的分?jǐn)?shù)(Fraction of Sample)描述了樣本在群體之間的分布情況,在這種情況下,84.7% 的樣品是單體。蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)(Fraction of Protein)表示樣品中衣殼的百分比;在這種情況下,單體是99.8%的衣殼。這證實(shí)樣品是空的 rAAV5 。從這種單一分析方法中獲得的另一個(gè)關(guān)鍵信息是樣品滴度;在這種情況下,對(duì)于空的 rAAV5,測(cè)得的滴度為 5.91x1013 vp/mL。
2,完整 rAAV5 衣殼分析
完整 rAAV5衣殼的SEC-MALS (OMNISEC) 分析如圖2和表3所示。對(duì)于主要的單體峰,計(jì)算出的符合Mw為4.49 x 106 g/mol,其中86%為衣殼。這樣,完整的rAAV5的蛋白質(zhì)組分的Mw為3.86 x 106 g/mol,與表2中的空rAAV5衣殼生成的數(shù)據(jù)一致。單體部分占比93%,樣品具有總滴度7.48 x 1013 vp/mL。
圖2 完整 rAAV5 的三重色譜圖
表3 完整 rAAV5 的定量參數(shù)
3,rAAV5 穩(wěn)定性研究
病毒衣殼的穩(wěn)定性和功能是一種平衡行為。病毒衣殼必須足夠穩(wěn)定以包含和保護(hù)其中的基因組,與宿主細(xì)胞表面結(jié)合,它們必須提供足夠的構(gòu)象穩(wěn)定性以在復(fù)制位點(diǎn)釋放基因貨物。
AAV載體脫殼的機(jī)制仍然知之甚少。衣殼脫殼和基因組釋放似乎需要結(jié)構(gòu)變化;诓钍緬呙锜晒夥ê筒钍緬呙枇繜岱ǎ―SC)收集的AAV熱穩(wěn)定性已發(fā)表數(shù)據(jù),AAV熱轉(zhuǎn)變的Tm值與衣殼解聚過(guò)程有關(guān),可作為AAV血清型的鑒定指標(biāo);一種血清型的空AAV衣殼和完整AAV衣殼的Tm值通常非常相似,并且它們與衣殼動(dòng)力學(xué)、衣殼脫殼和基因組釋放沒有明顯的相關(guān)性。
圖3 空rAAV5 和完整 rAAV5的DSC數(shù)據(jù)比較,扣除空白和基線的DSC數(shù)據(jù)。垂直方向標(biāo)記的區(qū)域具有明顯不同的熱轉(zhuǎn)變過(guò)程。
表4 從DSC獲得的空 rAAV5 和完整 rAAV5 樣品的熱穩(wěn)定性結(jié)果
文章中記錄的完整和空 rAAV5 樣品的DSC曲線疊加(圖3),根據(jù)空 rAAV5 和完整rAAV5 樣品的整體 DSC 圖譜差異以及熱穩(wěn)定性參數(shù)(如 Tonset 和 Tm2,表 4),可以在圖 3 中 DSC 曲線上識(shí)別出四個(gè)不同的區(qū)域,它們可以暫且歸因于以下幾點(diǎn):
#1■ 僅在完整的 rAAV5 中出現(xiàn)的區(qū)域,從50℃一直延展至 75℃,這個(gè)過(guò)程大約 30 分鐘。這可能歸因于熱應(yīng)激下衣殼蛋白結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性變化導(dǎo)致的 ssDNA 的動(dòng)力學(xué)控制下的注射;
#2■在空 rAAV5 中出現(xiàn)的最明顯的預(yù)轉(zhuǎn)變過(guò)程;
#3■ 主要轉(zhuǎn)變過(guò)程,即協(xié)同的 rAAV5 衣殼蛋白發(fā)生解組裝,這由具有血清型特異性的 Tm 值所決定;
#4■ 僅在完整 rAAV5 中出現(xiàn)的另外的轉(zhuǎn)變過(guò)程,很可能歸因于 ssDNA 的解鏈。
結(jié)論:以上幾例是綜合應(yīng)用馬爾文帕納科多種互補(bǔ)技術(shù)對(duì)基因治療常用的AAV載體一些關(guān)鍵屬性的表征,這些無(wú)標(biāo)記生物物理技術(shù)需要最少的方法開發(fā),可以從衣殼設(shè)計(jì)階段到開發(fā)、配方開發(fā)和藥物原料和產(chǎn)品進(jìn)行深入表征,加強(qiáng)體內(nèi)基因治療開發(fā)的分析工作流程。
詳細(xì)內(nèi)容可參文獻(xiàn) (Pharmaceutics 2021, 13(4), 586; https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13040586)
[1] Burnham, B.; Nass, S.; Kong, E.; Mattingly, M.; Woodcock, D.; Song, A.; Wadsworth, S.; Cheng, S.H.; Scaria, A.; O’Riordan, C.R. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum. Gene Ther. Methods 2015, 26, 228–242
關(guān)于馬爾文帕納科
馬爾文帕納科的使命是通過(guò)對(duì)材料進(jìn)行化學(xué)、物性和結(jié)構(gòu)分析,打造出更勝一籌的客戶導(dǎo)向型創(chuàng)新解決方案和服務(wù),從而提高效率和產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)利用包括人工智能和預(yù)測(cè)分析在內(nèi)的技術(shù)發(fā)展,我們能夠逐步實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。這將讓各個(gè)行業(yè)和組織的科學(xué)家和工程師可解決一系列難題,如提高生產(chǎn)率、開發(fā)更高質(zhì)量的產(chǎn)品,并縮短產(chǎn)品上市時(shí)間。
馬爾文帕納科 Zetasizer Ultra 納米粒度及Zeta電位分析儀具有真正的多角度動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(MADLS®),提供更高的粒度測(cè)量分辨率,及與角度無(wú)關(guān)的粒度結(jié)果,并能夠測(cè)量顆粒濃度。馬爾文帕納科 MICROCLA PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀能夠幫助用戶快速確認(rèn)維持高級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的最佳條件,提供簡(jiǎn)潔、無(wú)縫的工作流程和自動(dòng)化批量數(shù)據(jù)分析,其所提供的熱穩(wěn)定性信息被業(yè)內(nèi)視為“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù),是一種非標(biāo)記、全局性的數(shù)據(jù)。馬爾文帕納科OMNISEC凝膠滲透色譜儀是一套完整的凝膠滲透/尺寸排阻色譜(GPC)/(SEC),有前端色譜分離系統(tǒng)、檢測(cè)器和軟件組成,是靈敏準(zhǔn)確的多檢測(cè)器GPC/SEC 系統(tǒng),可以準(zhǔn)確測(cè)定:絕對(duì)分子量和分子量分布,特性粘度和分子結(jié)構(gòu),樣品濃度 以及其他多種關(guān)鍵參數(shù)。
聯(lián)系我們:
馬爾文帕納科
銷售熱線: +86 400 630 6902
售后熱線: +86 400 820 6902
聯(lián)系郵箱:info@malvern.com.cn
官方網(wǎng)址:www.malvernpanalytical.com.cn