HINT-快速檢測和評價冠狀病毒藥物的方法實例
COVID-19 的出現(xiàn)，使全球的公共衛(wèi)生面臨了嚴峻的挑戰(zhàn)。盡快開發(fā)針對SARS-CoV-2的藥物和疫苗是科學家們的當務(wù)之急。根據(jù)以往的經(jīng)驗，具有病毒中和能力的單克隆抗體在這兩方面應用都具有很好的潛力。本文將為大家介紹由美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）, 美國疾病預防控制中心（CDC）, MedImmune 等權(quán)威機構(gòu)及制藥公司開發(fā)及推薦的快速篩選病毒中和抗體的新方法。
病毒中和抗體的功能研究主要涉及兩方面:病毒結(jié)合和中和能力。抗體結(jié)合能力通常采用ELISA、生物膜干涉技術(shù) （Biolayer Interferometry, BLI）、流式細胞術(shù)（FACS）等方法研究�？贵w中和能力通常通過假病毒報告基因或病毒蝕斑減少中和實驗（PRNT）來評估。但以上幾種方法均存在各自的弊端與局限性（見下表），難以滿足嚴峻疫情下快速高通量篩選的迫切要求。因此，開發(fā)快速有效地檢測抗體結(jié)合和功能的方法，將有助于評估和篩選靶向病毒的抗體。
近年來，研究者們開發(fā)出了一種稱為“HINT” (High Content Imaging-Based Neutralization Test)的方法，通過高內(nèi)涵成像設(shè)備對微孔板中的熒光標記樣本進行高速成像和分析，快速得出反映抗體結(jié)合與中和能力的實驗數(shù)據(jù)。
SARS-CoV-2 于2020年2月11日被WHO正式命名。它也是繼SARS-CoV（嚴重急性呼吸綜合征病毒）和MERS-CoV（中東呼吸綜合征病毒）之后人類歷史上第三種可引發(fā)致命疾病的冠狀病毒。這里我們就以NIH在2019年發(fā)表的一篇文章為例，給大家詳細介紹研究者們?nèi)绾斡肅eligo全視野細胞掃描分析儀開展HINT實驗來檢測和評估MERS-CoV中和抗體的功能的(點擊文末“閱讀全文”下載文獻) 。
MERS-CoV與SARS-CoV-2 的病毒結(jié)構(gòu)類似，在病毒顆粒表面均具有突刺（S）蛋白。S蛋白的原聚體包括兩個部分，一個是頭部區(qū)域（S1），有助于病毒的附著；另一個是莖區(qū)（S2），包括融合復合物。MERS-CoV S1進一步分為與宿主細胞受體二肽基肽酶-4（DPP4）結(jié)合的受體結(jié)合域（RBD）與N-末端結(jié)構(gòu)域（NTD）[1，2]。由于RBD涉及到受體結(jié)合，所以目前很多抗體開發(fā)都集中于MERS-CoV的RBD [3，4，5]。隨著對全長MERS-CoV S蛋白三聚體的結(jié)構(gòu)解析 [6，7]，其他區(qū)域也成為了潛在的抗體靶點。許多開發(fā)出的單克隆抗體在動物模型中已經(jīng)顯示出治療潛力 [3，4，5，8]，而且多克隆抗體也在I期臨床中被證明具有安全性 [9]，但是尚無MERS-CoV特異性抗體被批準在人體使用。
研究者們利用Celigo全視野細胞掃描分析儀開發(fā)了一種高通量蛋白結(jié)合抑制檢測方法，能直接通過圖像和分析判斷蛋白或抗體與靶細胞的結(jié)合能力。Celigo可以在明場和熒光通道中直接捕獲和分析微孔板中用熒光抗體標記的細胞圖像，避免了細胞裂解或胰酶消化等過程對細胞自然狀態(tài)的干擾。Celigo的操作流程十分簡單，不需要特殊的材料或耗時的維護。
選擇DPP4高表達細胞類型用于抗體結(jié)合和抑制分析
二肽基肽酶-4 (DPP4)是MERS-CoV進入宿主細胞的受體。為了更好地在細胞水平研究MERS-CoV，研究者們需先建立DPP4高表達株。A549, BHK21和VeroE6細胞被轉(zhuǎn)染了不同濃度的DPP4 質(zhì)粒。兩天后，細胞被固定和染色。Celigo對所有樣本進行全孔成像并識別單個細胞的熒光強度。數(shù)據(jù)以FCS文件導出至FlowJo 10軟件進行轉(zhuǎn)染效率分析。BHK-21在0.1 µg質(zhì)粒濃度顯示出了最高表達，因而被選擇用于后續(xù)分析。
優(yōu)化用于抗體結(jié)合和抑制檢測的細胞數(shù)
優(yōu)化細胞接種密度對于基于熒光的細胞分析至關(guān)重要。細胞數(shù)太少會降低數(shù)據(jù)的可重復性，細胞數(shù)太高可能會造成細胞堆疊，影響分析。研究者們將不同密度的BHK-21細胞接種過夜并轉(zhuǎn)染DPP4, 通過Celigo的明場通道查看和分析細胞形態(tài)和融合率，最終選擇5×10^3個細胞/孔作為最佳接種密度。
開發(fā)基于圖像分析的病毒蛋白結(jié)合檢測方法
為了確定病毒蛋白與DPP4高表達BHK-21細胞結(jié)合的適合條件，研究者們對多個參數(shù)進行了優(yōu)化：蛋白構(gòu)建體（MERS-CoV S三聚體或S1單體），蛋白量（0.1–10 µg）和染色方案（AL488抗His-Tag 抗體、不同的MERS-CoV單克隆抗體和AF488抗MERS-CoV S蛋白抗體 ）。在蛋白構(gòu)建體方面，Celigo的熒光細胞圖片顯示MERS-CoV S三聚體和S1單體都能有效地結(jié)合到細胞上。然而熒光強度分析說明，與S1單體相比，MERS-CoV S三聚體顯示出比對照組更大的峰移。此外，利用全長MERS-CoV S三聚體可以評估抗體與整個S蛋白的相互作用。因此，MERS-CoV S三聚體被用于后續(xù)的實驗。
開發(fā)基于圖像分析的病毒蛋白結(jié)合抑制檢測方法
RBD特異性抗體通過阻斷S蛋白和DPP4的結(jié)合，從而主導了MERS-CoV的宿主免疫原性反應�？贵w也可以作用于其他表位，包括NTD和S2區(qū)域。研究者們測定了結(jié)合MERS-CoV S不同區(qū)域的單克隆抗體抑制MERS-CoV S與DPP4表達細胞的結(jié)合能力。以下的流程圖為該方法的實驗步驟。
Celigo通過綠色（AL488）、紅色（PE）和藍色（DAPI）熒光通道對樣本進行了全孔成像和分析熒光細胞圖片顯示D12抗體（RBD特異性）（圖4A，B）和G2抗體（NTD特異性，數(shù)據(jù)未顯示）均以劑量依賴性方式抑制MERS-CoV S蛋白結(jié)合，病毒S蛋白的熒光強度（綠色熒光）隨著抗體濃度的降低而減弱。FlowJo分析結(jié)果表明這兩種抗體具有相似的IC50值（～7.5 nM），和它們已知的與MERS-CoV S的結(jié)合常數(shù)具有可比性 [5]。此結(jié)果與先前證明這些單克隆抗體與MERS-CoV S1結(jié)合的BLI實驗結(jié)果一致。作為陰性對照，G4抗體的結(jié)合區(qū)域為S2,在空間上與RBD-DPP4的相互作用較遠，因此沒有顯示出任何抑制作用，如圖4E所示。
用假病毒中和實驗驗證結(jié)合抑制結(jié)果
以往的研究顯示，測試的三種單克隆抗體（G2，D12和G4）都可有效中和MERS-CoV假病毒感染天然表達DPP4的Huh 7.5細胞 [5]。為了驗證抑制結(jié)果的可靠性，研究者們進行了MERS-CoV England 1假病毒中和實驗，以確定抗體對表達DPP4的BHK21細胞的中和模式與結(jié)合抑制方式是否相似。正如所預期的，G2和D12具有相似的中和曲線（圖5），IC50值在0.5–0.8 nM范圍內(nèi)。而G4的IC50（圖5）比D12和G2高一個數(shù)量級，與結(jié)合抑制結(jié)果一致。以往的研究也在Huh 7.5細胞中顯示出D12 / G2和G4之間存在相同數(shù)量級的差異 [5]。
結(jié)語
近年來，HINT已被多家機構(gòu)和制藥公司用于病毒的抗體中和能力檢測，例如被美國CDC用于H3N2型甲流病毒 [10], MedImmune用于呼吸道合胞病毒 [11]，中國食藥監(jiān)局用于H7N9型禽流感病毒等 [12]。HINT中的”Neutralization”（中和）不僅指抗體的中和作用，也可以廣義地理解為非抗體類病毒藥物/疫苗抑制病毒感染細胞的能力，因此在mRNA、DNA疫苗，佐劑，化學合成藥物等的評估中也有很好的應用潛力。Celigo全視野細胞掃描分析儀具有分析整孔細胞的能力，在96孔板中掃描所有樣品僅需10-15分鐘，并且可以得到細胞數(shù)，細胞形態(tài)和熒光表達（包括未轉(zhuǎn)染的細胞，細胞面積，平均熒光強度和總熒光強度）等結(jié)果。該方法可以快速地優(yōu)化試驗參數(shù)，例如細胞接種密度、細胞類型、蛋白選擇和染色方法。另外，一塊微孔板上可設(shè)置多個復孔和比較各種條件組合，能大大降低實驗成本。Celigo高通量、高速度的特點以及強大的軟件分析能力結(jié)合HINT技術(shù)可加速抗病毒藥物和疫苗的開發(fā)，成為研究傳染病的一種有價值的工具。
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參考文獻
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