結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率和死亡率分別位居第二位和第三位。結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，約20%的結(jié)直腸癌患者在診斷時(shí)就已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對(duì)于轉(zhuǎn)移病灶不可切患者的治療主要以姑息性化療和靶向治療為主，其治療效果差強(qiáng)人意。
 

　　2018 年諾貝爾醫(yī)學(xué)及生理學(xué)獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)?wù)呙绹?guó)德克薩斯大學(xué)的免疫學(xué)家詹姆斯·艾利森（James Allison）和日本日本京都大學(xué)的免疫學(xué)家本庶佑，他們的研究提供了一種通過(guò)刺激免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的癌癥治療方法，并且基于這些研究也開(kāi)發(fā)出了相應(yīng)的藥物，人類(lèi)在治療腫瘤上已經(jīng)取得了非常重要的突破。然而，由于腫瘤致病機(jī)理復(fù)雜、患者個(gè)體的差異性也很大，再加上環(huán)境因素的影響，最終的治療效果仍然達(dá)不到人們的滿意。廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院徐學(xué)虎教授團(tuán)隊(duì)設(shè)想通過(guò)探索過(guò)繼免疫細(xì)胞輸注治療的方向，以期能改善目前對(duì)晚期結(jié)直腸癌的治療現(xiàn)狀。

　　過(guò)繼免疫細(xì)胞輸注治療是一種不同于免疫檢查點(diǎn)抑制劑的新型的抗腫瘤免疫治療模式。其中嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T）被認(rèn)為是當(dāng)前最具前景的抗腫瘤治療方式之一。而嵌合抗原受體NK細(xì)胞免疫治療（CAR-NK）異曲同工之妙，將修飾的免疫細(xì)胞由T細(xì)胞變?yōu)镹K細(xì)胞，而且有越來(lái)越多的臨床前研究表明CAR-NK細(xì)胞同樣具有顯著的抗瘤能力。
 

　　徐學(xué)虎教授團(tuán)隊(duì)近日在醫(yī)學(xué)1區(qū)雜志《Molecular Therapy》（IF：7.008）上報(bào)道了“NKG2D-CAR基因修飾的NK治療結(jié)直腸癌患者的臨床研究”的試驗(yàn)結(jié)果。這是一項(xiàng)單臂、開(kāi)放，劑量遞增的單中心的初期臨床研究，共入組了3例經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療失敗的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者。

　　在臨床前研究階段，鑒于包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞均高表達(dá)NKG2D配體的特征，而在正常組織中其表達(dá)含量很低或無(wú)，所以團(tuán)隊(duì)成員選擇腫瘤相關(guān)抗原--NKG2D配體作為治療靶點(diǎn)，并通過(guò)電穿孔的手段將NKG2D-mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)NK細(xì)胞，成功構(gòu)建了靶向NKG2D配體的CAR-NK細(xì)胞。

　　首先，徐學(xué)虎教授團(tuán)隊(duì)利用了NEPA21（電轉(zhuǎn)染儀）  mRNA電穿孔方法（來(lái)自 NEPAGENE公司的 NEPA21 高效基因電轉(zhuǎn)染系統(tǒng) ），從體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均展示了NKG2D CAR-NK細(xì)胞對(duì)高表達(dá)NKG2D配體的腫瘤細(xì)胞顯著的特異性殺傷能力。為了比較NKG2Dz和NKG2Dp mRNA-CARs電穿孔NK細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，在相同的供體和相同的對(duì)照條件下，用相同量的mRNA-CARs電穿孔NK細(xì)胞，利用EGFP mRNA在NK細(xì)胞中優(yōu)化RNA電穿孔，其轉(zhuǎn)染效率接近99%（圖S2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NKG2Dp-CAR修飾的NK細(xì)胞更有效地殺傷癌細(xì)胞�；�于這些結(jié)果，NKG2Dp-CAR修飾的NK細(xì)胞作為動(dòng)物和臨床試驗(yàn)的研究目標(biāo)。

　　為了驗(yàn)證NKG2D RNACAR修飾的NK細(xì)胞在體內(nèi)的抑瘤作用，建立異種植入人結(jié)直腸癌細(xì)胞株的NSG小鼠模型，利用活體生物成像技術(shù)(BLI)比較分別給予phosphate-buffered saline (PBS), NK細(xì)胞和NKG2DCAR-NK細(xì)胞處理的小鼠體內(nèi)腫瘤負(fù)荷光信號(hào)，結(jié)果顯示PBS組小鼠平均生存時(shí)間為36天，低于NK細(xì)胞組小鼠平均45天的水平，說(shuō)明NK細(xì)胞對(duì)延緩腫瘤生長(zhǎng)提高小鼠生存時(shí)間具有一定療效，而NKG2D CAR-NK細(xì)胞組全部5只小鼠的腫瘤生長(zhǎng)被抑制，并且平均生存時(shí)間提高到69天，由此可見(jiàn)，CAR-NK細(xì)胞能夠有效的殺傷小鼠體內(nèi)腫瘤。

　　隨后，對(duì)3例化療難治性轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進(jìn)行了一項(xiàng)初步臨床試驗(yàn)研究，以評(píng)價(jià)NKG2Dp-CAR基因表達(dá)修飾的NK細(xì)胞過(guò)繼細(xì)胞治療的安全性和可行性。先為三例病人制備CAR-NK細(xì)胞，并展示了用于患者治療的CAR-NK細(xì)胞的產(chǎn)生和特性，包括CAR-NK細(xì)胞釋放標(biāo)準(zhǔn)和電穿孔后CAR-NK細(xì)胞的活性（圖S4）。

　　隨后，在臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證NKG2D-CAR基因修飾的NK細(xì)胞過(guò)繼治療的安全性和可行性。研究一共入組了3例經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療失敗的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，前兩例為有腹腔轉(zhuǎn)移伴惡性腹水患者，以劑量遞增的形式通過(guò)腹腔輸注的方式分別給予2次（2×107-1×108個(gè)CAR-NK細(xì)胞）和4次（1×108-7×108個(gè)CAR-NK細(xì)胞）細(xì)胞輸注，每周一次。治療過(guò)程中和結(jié)束后，可觀察到24小時(shí)腹水生成量以及腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)的顯著減少；同時(shí)，第二位患者CT平掃亦顯示治療后腹腔內(nèi)腹水含量較基線減少；腹水性狀從渾濁狀變?yōu)榈�黃色澄清狀。

　　第三例為腹腔轉(zhuǎn)移伴不可切除的肝轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，一共給予6次（5×108-2×109個(gè)CAR-NK細(xì)胞）細(xì)胞輸注，每周兩次。從第二次輸注開(kāi)始，一半細(xì)胞通過(guò)超聲引導(dǎo)下局部輸注至PET-CT顯示為高代謝活性的肝右后葉下段（S6），剩余細(xì)胞則通過(guò)腹腔內(nèi)輸注。治療結(jié)束后，通過(guò)治療前后PET-CT對(duì)比，可觀察到局部輸注腫瘤灶（S6）的代謝恢復(fù)至背景值，且通過(guò)組織切片染色證明局部輸注腫瘤組織的大量壞死。

　　本研究報(bào)道的NKG2D-CAR基因修飾的NK細(xì)胞過(guò)繼輸注為提高腫瘤免疫治療效果提供了一種新的選擇，尤其是在發(fā)展通用安全的“貨架型”CAR療法用于異基因細(xì)胞治療方面尤其具有吸引力。

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