近年來，由于細(xì)胞治療方法的興起，人們?nèi)找嫘枨竽軌蚋哔|(zhì)量、穩(wěn)健、有效進(jìn)行細(xì)胞表征測定的方法。細(xì)胞計(jì)數(shù)，作為細(xì)胞療法中最基礎(chǔ)的檢測項(xiàng)目，現(xiàn)今需要更高的檢測可信度。2017年4月，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）&食品與藥物管理局（FDA）共同舉辦了一場專注于細(xì)胞計(jì)數(shù)的研討會(huì)，聚焦于選擇、設(shè)計(jì)和驗(yàn)證細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，以及如何得到充分的計(jì)量保證。近50位來自于工業(yè)界、學(xué)術(shù)界和政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)的專家參與了研討會(huì)。Nexcelom Bioscience作為為數(shù)不多的受邀細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備制造商之一列席參加了本次會(huì)議，與業(yè)界專家們共同討論細(xì)胞治療中關(guān)于細(xì)胞計(jì)數(shù)的各種問題。本文總結(jié)了此次會(huì)議的討論重點(diǎn)。
研討會(huì)的總體主題：我們需要根據(jù)細(xì)胞樣品的屬性，細(xì)胞計(jì)數(shù)的目的和要求，來選擇適合目的（fit-for purpose）的測量方法。例如，藥物篩選和細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)與放行過程中的細(xì)胞計(jì)數(shù)要求會(huì)有顯著不同。Fit-for purpose是指選擇的方法是否適合細(xì)胞計(jì)數(shù)的預(yù)期目的。理想的適用性需要滿足兩方面的要求，一是能解決生物學(xué)問題，二是獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量（靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度）足夠好，足以支持下游決策。一個(gè)更標(biāo)準(zhǔn)化的設(shè)計(jì)、限定和驗(yàn)證符合fit-for purpose原則的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的流程，將加速產(chǎn)品的開發(fā)和轉(zhuǎn)化。
研討會(huì)上討論的主要內(nèi)容：
細(xì)胞計(jì)數(shù)測量過程
細(xì)胞計(jì)數(shù)遵循相同的常規(guī)步驟：（i）樣品準(zhǔn)備，（ii）手工計(jì)數(shù)或使用儀器設(shè)備的自動(dòng)計(jì)數(shù)，（iii）數(shù)據(jù)分析（如圖1）。 Figure 1. General cell counting measurement process (Adapted from Lin-Gibson et al. Bioinsights, 2016).
測量過程中的很多方面都可能給結(jié)果帶來顯著的可變性。此外作為測量過程中“輸入”的細(xì)胞樣品，屬性可能會(huì)有大范圍的波動(dòng)，也會(huì)給計(jì)數(shù)結(jié)果帶來顯著的可變性。細(xì)胞樣品本身就很復(fù)雜，具有一系列穩(wěn)定或者變化的性質(zhì) - 樣品配方（如培養(yǎng)基組分）、成分（如不同細(xì)胞類型和功能）和固有的生物學(xué)可變性（如供體變化和細(xì)胞狀態(tài)）。認(rèn)識(shí)到細(xì)胞計(jì)數(shù)過程和細(xì)胞樣品相關(guān)的各種影響因素，研討會(huì)上專家們討論了提高細(xì)胞計(jì)數(shù)可信度的策略。
從監(jiān)管角度看細(xì)胞計(jì)數(shù)

Figure 2. Analytical method development flow diagram through stages of cell-based product development and regulatory approval. For the purpose of this figure, the following definitions apply: assay qualification, determining if an assay is suitable for its intended purpose; assay validation, assuring that the assay is suitable to its intended purpose on a routine basis. (Courtesy of Steven Bauer, FDA)
FDA的與會(huì)人員強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞計(jì)數(shù)對于檢測細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量（如屬性、純度、效價(jià)和劑量）的重要性。他們重申基于不同目的，最適合的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法可能不同，這主要取決于細(xì)胞治療產(chǎn)品本身。他們進(jìn)一步指出，雖然在獲得許可證之前，細(xì)胞計(jì)數(shù)等試驗(yàn)方法不需要進(jìn)行驗(yàn)證；但越早建立高可信度的方法，越有利于產(chǎn)品轉(zhuǎn)化（圖2）。FDA與會(huì)人員特別指出：確定適當(dāng)?shù)募?xì)胞計(jì)數(shù)方法，了解可用的儀器，有助于共識(shí)性文件標(biāo)準(zhǔn)的制定和參考樣品的開發(fā)，有利于解決再生醫(yī)學(xué)療法中細(xì)胞計(jì)數(shù)方面的挑戰(zhàn)。
建立細(xì)胞計(jì)數(shù)方面的質(zhì)量屬性
細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量屬性可通過測定相關(guān)的、可測量的生物學(xué)指標(biāo)來評估。許多質(zhì)量屬性直接（如總細(xì)胞濃度、活細(xì)胞濃度）或間接（如使用細(xì)胞濃度歸一化處理的活力數(shù)據(jù)）使用細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果獲得數(shù)據(jù)。選擇細(xì)胞計(jì)數(shù)方法時(shí)，要明確理解測量對象和預(yù)期質(zhì)量屬性之間的關(guān)系（如活細(xì)胞濃度、存活率百分比）。
例如活細(xì)胞濃度是一種差異細(xì)胞計(jì)數(shù)，需要將活細(xì)胞與死細(xì)胞區(qū)分開，與細(xì)胞類型無關(guān)。活細(xì)胞濃度又可以進(jìn)一步分解成兩個(gè)屬性組成：活細(xì)胞數(shù)和樣品體積。
測定活細(xì)胞數(shù)時(shí)，很多生物學(xué)指標(biāo)可以用來區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。這些生物學(xué)指標(biāo)包括細(xì)胞膜完整性、代謝活力和細(xì)胞復(fù)制能力。生物學(xué)指標(biāo)可以通過不同測試方法測定，且每種測試方法都有不同的測量對象。例如臺(tái)盼藍(lán)排除和DAPI核酸染色法都可以通過測試細(xì)胞膜完整性來區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。對同一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)的類似檢測，不同染料（大小、親和力不同）對細(xì)胞膜滲透性的固有不同和顯示信號(hào)（比色或者熒光）的不同，也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果上的差異。
另一個(gè)屬性組成是樣品的體積。體積可以通過校準(zhǔn)過的儀器來獲得（例如已測定的計(jì)數(shù)室尺寸）：間接方法如同時(shí)用基于流式原理的方法測定已知濃度的微珠；或者通過流量計(jì)等方法直接測定。體積測定偏差將導(dǎo)致結(jié)果偏差，降低活細(xì)胞濃度測定結(jié)果精密度。另外在測試活細(xì)胞濃度時(shí)，儀器與儀器之間結(jié)果的差異，有些情況下可能是因?yàn)閮x器體積校準(zhǔn)之間的差異造成的。
總的來說，應(yīng)選擇反映預(yù)期測量目的的生物學(xué)指標(biāo)；當(dāng)應(yīng)用這些生物學(xué)指標(biāo)時(shí)，能夠反映細(xì)胞治療產(chǎn)品的作用機(jī)理。此外，測量目標(biāo)應(yīng)盡可能與生物學(xué)指標(biāo)直接相關(guān)。專家強(qiáng)調(diào)需要了解細(xì)胞計(jì)數(shù)的生物學(xué)基礎(chǔ)，特別是當(dāng)某個(gè)細(xì)胞亞群被認(rèn)為與生物學(xué)或臨床結(jié)果相關(guān)時(shí)的差異細(xì)胞計(jì)數(shù)。
選擇與設(shè)計(jì)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法
自18世紀(jì)以來，使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行手工計(jì)數(shù)一直被認(rèn)為是細(xì)胞計(jì)數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。研討會(huì)的參會(huì)人員表示這種觀點(diǎn)現(xiàn)在依然存在。手工計(jì)數(shù)非常費(fèi)時(shí)，并且誤差很大，會(huì)給產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)帶來很多問題。隨著技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在許多基于自動(dòng)成像和流式原理的方法被用來進(jìn)行總細(xì)胞和亞細(xì)胞群計(jì)數(shù)。可選的方法很多，樣品類型以及細(xì)胞計(jì)數(shù)目的也各不相同。
細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測過程的考慮因素大致上可以分為：（i）生物學(xué)相關(guān)因素；（ii）測量特性相關(guān)因素，包括計(jì)量保證策略；（iii）合規(guī)性及其他實(shí)際因素。生物學(xué)相關(guān)因素是指計(jì)數(shù)方法基于生物學(xué)指標(biāo)獲得細(xì)胞數(shù)量的能力。分析方法的測量特性相關(guān)因素包括計(jì)數(shù)方法提供足夠特異、精密和穩(wěn)健數(shù)據(jù)的能力；控制測量過程中的可變性并確保過程中的可信度的能力也是需要的；另一個(gè)需要重點(diǎn)考慮的因素是方法在產(chǎn)品研發(fā)管線各個(gè)環(huán)節(jié)中的轉(zhuǎn)化能力。理想情況下，研發(fā)過程中使用的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法應(yīng)該能夠應(yīng)用到生產(chǎn)甚至放行中。細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)需要盡量少的可變因素和校準(zhǔn)要求，最好內(nèi)置自控系統(tǒng)。緊接下來需要考慮的就是合規(guī)性，包括是否滿足GMP （Good Manufacturing Practice）要求。如果不止使用一種計(jì)數(shù)方法，或者在不同地點(diǎn)使用同一種方法，需要考慮方法之間的可比性。其他需要考慮的實(shí)際因素包括：用量、價(jià)格、所需時(shí)間以及培訓(xùn)。一個(gè)特別需要指出的挑戰(zhàn)是計(jì)數(shù)方法能夠允許使用者自行修改調(diào)整的程度。儀器提供越多的微調(diào)設(shè)置，將提供更大的靈活性和可優(yōu)化性；另一方面，增加儀器的靈活性意味著需要更多的培訓(xùn)，以及在生產(chǎn)中做更多記錄。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）在優(yōu)化細(xì)胞計(jì)數(shù)流程中的應(yīng)用
一旦細(xì)胞計(jì)數(shù)的目的和大致方法已經(jīng)確定，建議使用“實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（Design of Experiments ，DOE）來進(jìn)行方法優(yōu)化和穩(wěn)健性測試。
專家指出很多因素影響了細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。這些因素包括準(zhǔn)備細(xì)胞樣品時(shí)使用的稀釋液。稀釋液可能影響樣品的穩(wěn)定性，引入或者減少影響計(jì)數(shù)的碎片或雜質(zhì)。儀器與儀器之間的差異也是一個(gè)挑戰(zhàn)，需要使用更穩(wěn)健的體積校準(zhǔn)策略來改進(jìn)，例如使用已知濃度的微珠或其他體積校準(zhǔn)方法。很多因素會(huì)影響細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，精心設(shè)計(jì)的DOE有助于理解每個(gè)因素的作用以及各個(gè)因素在細(xì)胞計(jì)數(shù)過程中的聯(lián)系。
細(xì)胞計(jì)數(shù)驗(yàn)證
基于現(xiàn)有的經(jīng)驗(yàn)，很多參會(huì)者推薦了國際人類用藥物技術(shù)要求協(xié)調(diào)理事會(huì)（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）的指南：“Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) for Validation of Analytical Methods”【1】用于細(xì)胞計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證。ICH傳統(tǒng)上專注于藥物制造，而不是細(xì)胞治療產(chǎn)品。指南中描述了準(zhǔn)確度、精密度、特異性、檢測限、定量限、線性、范圍和穩(wěn)健性的概念。這個(gè)通用的驗(yàn)證框架在很大程度上適用于細(xì)胞的分析測量，但對于細(xì)胞治療產(chǎn)品要做出一些針對性的調(diào)整。
受限于動(dòng)態(tài)、復(fù)雜，有時(shí)數(shù)量還有限的樣品，需要對驗(yàn)證步驟進(jìn)行改變，或者增加額外的考量。例如在考察細(xì)胞計(jì)數(shù)中間精密度（不同操作者、不同儀器、不同日期、不同批次之間的差異）時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)需要考慮整個(gè)周期中樣品的穩(wěn)定性，尤其需要考慮可能影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的樣品性質(zhì)（如細(xì)胞活率、細(xì)胞聚集、碎片和氣泡形成等）。 Figure 3. Acceptability of cell counting measurements. Typical cell counting measurements are evaluated and optimized for precision, however, due to the lack of appropriate reference materials, accuracy is not always well understood.
準(zhǔn)確度對細(xì)胞計(jì)數(shù)來說，是個(gè)獨(dú)特的挑戰(zhàn)。理想的細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果應(yīng)該既精密又準(zhǔn)確。細(xì)胞計(jì)數(shù)的精密度可以通過實(shí)驗(yàn)確定。但因?yàn)槿鄙俸线m的參考樣品和對照方法，細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度很難獲得。
評估準(zhǔn)確度一般是通過對比測定結(jié)果與具有參考值和已知不確定性的恰當(dāng)參考樣品的檢測結(jié)果，或者通過與對照方法進(jìn)行比較。因?yàn)榧?xì)胞計(jì)數(shù)測定缺少通用的參考樣品，基于人工顯微鏡觀察計(jì)數(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”也具有很大的偏差和不精密性，通過上述方法檢測準(zhǔn)確度不能滿足細(xì)胞治療產(chǎn)品對準(zhǔn)確度的要求。
為了滿足工業(yè)界的需要，NIST近期開發(fā)出了在沒有合適對照方法和樣品的情況下，評估細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的策略。這些方法通過系列稀釋試驗(yàn)設(shè)計(jì)，評估了細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的精密度和比例性。在這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果對梯度稀釋的比例響應(yīng)作為評價(jià)計(jì)數(shù)質(zhì)量的內(nèi)部基準(zhǔn)【2】。這個(gè)過程不受測定方法和細(xì)胞類型的影響，提供了不依賴于“金標(biāo)準(zhǔn)”方法或參考樣品比較，就可以評估細(xì)胞計(jì)數(shù)方法質(zhì)量的途徑。這個(gè)策略的目標(biāo)就是解決細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)者在細(xì)胞計(jì)數(shù)方法轉(zhuǎn)型或者選擇“fit for purpose”計(jì)數(shù)方法時(shí)遇到的挑戰(zhàn)。
細(xì)胞計(jì)數(shù)的生物或非生物參考樣品及內(nèi)參
合適的參考樣品將極大的有助于對細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度的評估，有利于對細(xì)胞計(jì)數(shù)方法之間進(jìn)行比較。因此，研討會(huì)討論中很重要的一部分就集中在現(xiàn)今細(xì)胞計(jì)數(shù)參考樣品的使用和參考樣品的需求上。會(huì)上達(dá)成了一個(gè)重要共識(shí)：使用者需要理解各種參考樣品在計(jì)數(shù)過程中的作用。細(xì)胞治療從業(yè)者需要優(yōu)化的或者新的參考樣品來評估細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度。會(huì)上討論了生物的（基于細(xì)胞）和非生物的（主要是微珠）參考樣品的作用。有人指出針對測定過程的特定方面需要選擇合適的參考樣品，且不應(yīng)在其預(yù)期使用目的之外進(jìn)行過度解讀。
細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)量保證策略
為了保證測量結(jié)果的質(zhì)量，需要使用基于計(jì)量科學(xué)原則的計(jì)量保證策略。理想的測量結(jié)果由以下3點(diǎn)構(gòu)成：（i）以常用單位表示的數(shù)值，（ii）測量不確定度，（iii）可以保證測量結(jié)果質(zhì)量的證據(jù)。對細(xì)胞計(jì)數(shù)來說，了解測量過程是否會(huì)以及何時(shí)會(huì)達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)很重要。在這種情況下，需要設(shè)計(jì)計(jì)量保證策略以提供足夠的證據(jù)來監(jiān)測測量過程的質(zhì)量，提供計(jì)數(shù)結(jié)果是否可靠的指示。測量保證的證據(jù)通常以測量過程中的中間測量形式出現(xiàn)，在整個(gè)測量過程中的特定點(diǎn)建立可信度。測量保證策略可以每年或每季度不定期實(shí)施，通過驗(yàn)證和SOP作為質(zhì)量保證計(jì)劃的一部分。儀器驗(yàn)證步驟等其他策略可以為每天的測量提供保證；或者與每次測量同時(shí)進(jìn)行，以提供每個(gè)測量值的可信度。 Figure 4. Example of a hypothetical cell counting measurement with in-measurement-process controls to provide evidence that the user should have confidence in the value obtained by the measurement process. Spec, specification; LOD, limit of detection.
當(dāng)計(jì)量保證策略應(yīng)用到每次測量中時(shí)，它們作為測量步驟中的控制環(huán)節(jié)，為測量過程提供同時(shí)驗(yàn)證。這種策略在長期記錄和監(jiān)測一種分析方法時(shí)非常有效，并能夠識(shí)別方法中的偏移和錯(cuò)誤。很多測量步驟中的控制環(huán)節(jié)可以直接使用細(xì)胞計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)，或者通過使用測試樣品即可進(jìn)行的簡單實(shí)驗(yàn)來完成。這樣的設(shè)計(jì)策略具有實(shí)際可操作性。例如，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果是單位體積的細(xì)胞數(shù)；在使用細(xì)胞計(jì)數(shù)值做出決策之前我們有幾個(gè)假設(shè)。這些假設(shè)包括：（i）細(xì)胞是懸浮于介質(zhì)中的單個(gè)物體，（ii）所有目標(biāo)細(xì)胞都被計(jì)數(shù)了，而其他的都被排除了，（iii）已知體積已經(jīng)被驗(yàn)證過，（iv）試劑和儀器工作正常，（v）檢測結(jié)果在線性范圍內(nèi)，在檢出限以上，在飽和限以下。在測量時(shí)需要收集證明以上假設(shè)是可信的證據(jù)。例如，需要設(shè)置對照試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析策略，在試劑出現(xiàn)問題、細(xì)胞過度聚集、流路堵塞、儀器狀態(tài)改變或預(yù)設(shè)體積錯(cuò)誤時(shí)提醒使用者。當(dāng)設(shè)置了合適的測量步驟中的控制環(huán)節(jié)，細(xì)胞計(jì)數(shù)測定過程的質(zhì)量才能獲得保證（圖4）。
總結(jié)：
本次細(xì)胞計(jì)數(shù)研討會(huì)的一個(gè)關(guān)鍵結(jié)論就是：獲得高質(zhì)量細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的方法并不是單一的。使用者必須要考慮細(xì)胞計(jì)數(shù)的目的，設(shè)計(jì)最合適的方法和計(jì)量保證策略。人們需要開發(fā)、鑒定和驗(yàn)證細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的通用策略和原則，這些前期的努力會(huì)決定后期標(biāo)準(zhǔn)化的考慮和努力方向。關(guān)于細(xì)胞計(jì)數(shù)的建議包括：（i）文件標(biāo)準(zhǔn)和最佳實(shí)踐指南，（ii）一致的術(shù)語，以實(shí)現(xiàn)共同理解和清晰的溝通，（iii）生物以及非生物參考樣品以提升計(jì)量保證，（iv）有別于“one-size fits all”觀念的，基于“fit-for-purpose”原則的個(gè)體化檢測策略。
Nexcelom Bioscience 作為受邀細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備供應(yīng)商之一參與了本次研討會(huì)，與多位同行、細(xì)胞治療從業(yè)者及政策法規(guī)制定者進(jìn)行了廣泛的交流和討論，也更加深入地了解了行業(yè)所面臨的挑戰(zhàn)以及業(yè)界對相關(guān)設(shè)備制造商的期望。作為細(xì)胞計(jì)數(shù)領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)品牌，Nexcelom責(zé)無旁貸，會(huì)一如既往地以技術(shù)創(chuàng)新為驅(qū)動(dòng)力，打造基于用戶需求的產(chǎn)品，為細(xì)胞治療產(chǎn)業(yè)和人類健康事業(yè)的發(fā)展貢獻(xiàn)應(yīng)有的力量！
[1] ICH. Validation of analytical procedures: text and methodology. In: Secretariat I, editor. ICH HarmonisedTripartite Guideline. Geneva, Switzerland: ICH; 2005.
[2] Sarkar S, Lund SP, Vyzasatya R, Vanguri P, Elliott JT, Plant AL, et al. Evaluating the quality of a cell counting measurement process via a dilution series experimental design. Cytotherapy 2017;19:1509–21.
 
Nexcelom和達(dá)科為
Nexcelom Bioscience于2003年成立于美國波士頓，是高性能細(xì)胞定量分析平臺(tái)開發(fā)和商業(yè)化的領(lǐng)導(dǎo)者。作為一家全球性公司。自2005年成功開發(fā)第一款細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Cellometer Auto T4并得到NIH客戶認(rèn)可以來，已陸續(xù)開發(fā)出Cellometer明場、熒光以及圖像類流式細(xì)胞定量分析儀系列。
2014年從Brooks生命科學(xué)部成功收購Celigo全視野原位細(xì)胞分析儀產(chǎn)品線，快速整合并提升公司在細(xì)胞定量技術(shù)上的研發(fā)能力和客戶應(yīng)用支持實(shí)力。
Cellometer和Celigo被廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)、免疫治療、疫苗開發(fā)、藥物評價(jià)等基礎(chǔ)生命科學(xué)研究以及釀酒、生物能源等工藝開發(fā)。目前，在全球范圍內(nèi)的裝機(jī)數(shù)已達(dá)5000多臺(tái)，被經(jīng)同行評議的文獻(xiàn)引用已超3200篇。
達(dá)科為生物作為Nexcelom公司在中國的總代理，和Nexcelom公司強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手，在中國擁有強(qiáng)大的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，提供專業(yè)的demo演示，以及售后支持和維護(hù)。