沉,過濾乙醇,得到提取液,將天麻、鬼箭羽、參醇提取液,共同濃縮成浸膏。3種工藝制備的浸膏,每mL均含0.34g生藥。鹽酸多奈哌齊(安理申),衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號1702012。鹽酸消旋山莨菪堿注射液(1mL:10mg),杭州民生藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號1710113。
 
1.3試劑
 
SOD試劑盒(批號2017012),由北京華英生物技術研究所提供。MDA試劑盒(批號20180408)、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-PX)試劑盒(批號20180412B)、一氧化氮(NO)試劑盒(批號20180412)、Ach試劑盒(批號20180410-)、AchE試劑盒(批號20180326),均由南京建成生物工程研究所提供。白介素1β(I4β)試劑盒(批號20180411)、腫瘤壞死因子α(TNFw)試劑盒(批號20180412),均由北京欣博盛生物科技有限公司提供�？偰懝檀�(TC)試劑盒(批號616386)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號612875)、高密度脂蛋白(HDLC)試劑盒(批號200769)、低密度脂蛋白(LDLC)試劑盒(批號209190),均由德國羅氏診斷有限公司提供。
 
1.4儀器
 
ZS901型 Morris水迷宮系統(tǒng),北京眾實迪創(chuàng)公司生產(chǎn)。A6型半自動生化檢測儀,北京松上技術有限公司生產(chǎn)。DR200BS型酶標半自動分析儀,無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司生產(chǎn)。
 
2方法
 
2.1分組及造模給藥
SD大鼠60只,隨機分為6組,每組10只,雌雄各半。①空白組:等體積純凈水灌胃;②模型組:等體積純凈水灌胃;③陽性對照藥組:鹽酸多奈哌齊片0.45mg/kg灌胃;④參麻益智方1號方組:1號方2.97g/kg灌胃:⑤參麻益智方2號方組:2號方2.97g/kg灌胃;⑥參麻益智3號方組:3號方2.97g/kg灌胃。參麻益智方3組及陽性對照藥組的藥物均以純凈水配置,給藥量均為成人臨床等效劑量,每組每天灌胃給藥1次,連續(xù)給藥4周。4周末,除空白組腹腔注射等體積芎按比例混勻進行水煎煮,濾出藥液,加入生理鹽水外,其余各組均按2mg/kg體重的劑量腹腔注射鹽酸消旋山莨菪堿注射液造成ⅤD大鼠模型4由于實驗人員操作不當,模型組大鼠死亡1只,未取得血液標本及腦組織標本。本研究經(jīng)中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過,動物實驗倫理批號2018XLC0042。
 
2.2檢測指標及方法
 
2.2.1行為學實驗:造模30min后進行 Morris水迷宮實驗。實驗共歷時6天,第1~5天上午將各組大鼠依次放入 Morris水迷宮系統(tǒng)尋找藏在水下的平臺,進行定位航行實驗訓練。如果大鼠在90s內找到平臺并在平臺上停留5s,則訓練停止。如果大鼠在90s內未找到平臺,則由實驗者將其引導至平臺并停留10s,每天訓練2次。第6天上午撤去原平臺進行空間探索實驗,記錄大鼠在90s內的原平臺象限活動路程、原平臺象限活動時間及穿臺次數(shù)。
 
2.2.2血清生化指標檢測:水迷宮測試后,以0.9%水合氯醛溶液按ΩmL/kg腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈取血,3000r/min離心15min,取上清液。采用比色法測定血清SOD、MDA、Ach、AchE、TG的含量;采用酶比色法測定TC、HDLC、LDLC的含量;采用酶聯(lián)免疫法( ELISA)測定I1β、TNFα水平;采用硝酸還原酶法測定血清NO水平;采用非酶促反應法測定血清中 GSH-PX含量。所有檢測步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.2.3海馬組織形態(tài)觀察:大鼠取血后,迅速取出腦組織,置于冰磚上,每組隨機選6只大鼠,雌雄各半,取出腦組織,10%中性甲醛溶液固定,常規(guī)切片,固定,脫水透明,浸蠟包埋,脫蠟染色、封固。光鏡下觀察各組大鼠腦組織病理改變及海馬CAl區(qū)病理形態(tài)學變化。
 
2.3統(tǒng)計學方法
 
采用SPS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,所有數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗。組間比較采用方差分析,兩兩比較,若方差齊采用LSD分析,方差不齊采用 Dunnett-檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
 
3結果
 
3.1各組大鼠海馬CA1區(qū)病理形態(tài)比較空白組大鼠海馬CA1區(qū)細胞排列較為致密整齊,胞體正常,細胞核及細胞質清晰,沒有細胞變性及壞死。模型組未見明顯的病理變化,其余各組與模型組比較無明顯差異。見封三圖1。
 
3.2各組大鼠空間學習記憶能力比較
 與模型組比較,參麻益智方3組原平臺象限活動路程、活動時間及穿臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與2號方組比較,3號方組穿臺次數(shù)增加顯著,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);3組間兩兩比較,其他指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

3.3各組大鼠血清TG、TC、HDLC、LDLC水平比較 與模型組比較,參麻益智方3組均可降低TC水平,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,3組TG、HDLC及LDLC,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);血脂四項指標3組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

3.4各組大鼠氧化應激指標比較
與空白組比較,模型組SOD活性顯著降低智方3組GSHⅩ活性、MDA含量差異無統(tǒng)計(P<0.05);與模型組比較,1號方組SOD活學意義,且3組間差異也無統(tǒng)計學意義顯著變化(P>0.05)。與模型組比較,參麻益升高(P<0.05),2號方組、3號方組無0.05)。見表3。

3.53組大鼠血清炎癥因子水平比較
與模型組比較,參麻益智方3組Ⅱβ、TNF-低、NO水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) α差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與模型組比與1號方組比較,2號方組TNFa及NO差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。1號方組比較,參麻益智方3組Ach、AchE含量差異均水平顯著升高(P<0.05)。見表4組

3.6各組大鼠膽堿能系統(tǒng)指標比較
 與模型組比較,多奈哌齊組大鼠的Ach含量無統(tǒng)計學意義(P>0.05),且3組間比較差異無統(tǒng)顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型計學意義(P>0.05)。見表5。

4討論
 VD是繼阿爾茨海默病的第2種常見癡呆類型,其發(fā)病率隨著社會老齡化逐年上升,嚴重影響患者的生活質量,給家庭和社會造成了嚴重的精神和經(jīng)濟負擔。VD發(fā)病的危險因素包括高血壓、高血脂、糖尿病、心臟疾病等因素,并與年齡、受教育程度、不良生活方式、抑郁癥等密切相關,其中高脂血癥是VD發(fā)病最常見的危險因素之一。有研究報道,對156例老年缺血性腦卒中患者發(fā)生ⅤD的危險因素分析表明合并高血壓病、高脂血癥、糖尿病等基礎疾病患者ⅤD的發(fā)病率明顯升高。目前認為VD的發(fā)病機制主要與膽堿能系統(tǒng)、氧化應激、炎癥反應、興奮毒性及細胞凋亡等相關。中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)在學習記憶中起重要作用,大量研究表明膽堿能系統(tǒng)受損與VD發(fā)生有關。腦缺血缺氧時會發(fā)生氧化應激過程,產(chǎn)生過量自由基。MDA是機體內自由基作用于脂質發(fā)生過氧化反應的主要降解產(chǎn)物,具有細胞毒性。SOD和GSHX是機體內清除自由基的關鍵酶,可以保護機體不受自由基的損害。腦缺血后的炎癥反應是一個級聯(lián)反應過程,其與腦組織缺血缺氧程度及再灌注密切相關。研究切表明,L1和TNFα作為炎癥因子參與VD炎癥反應過程。NO是腦血管內重要的神經(jīng)活性物質,對腦組織的血液循環(huán)起重要的生理調控作用,對腦神經(jīng)遞質細胞因子的合成和分泌起抑制或促進作用,并對記憶力和學習功能產(chǎn)生一定影響,當腦血管處于缺血低氧等病理狀態(tài)時,興奮性氨基酸分子表達水平明顯升高,進而有效激活N甲基一天冬氨酸( NADPH)受體,機體血清NO表達水平明顯升高。